[發明專利]一種提高非洲豬瘟病毒非靶細胞MA-104細胞系感染滴度的方法

在審

• 申請號: 202210029737.0
• 申請日: 2022-01-12
• 公開（公告）號: CN114410587A
• 公開（公告）日: 2022-04-29
• 發明（設計）人: 鄭海學;張克山;張婷;楊博;申超超;田宏;茹毅;楊帆;朱紫祥;馮濤;郭建宏;劉湘濤
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院蘭州獸醫研究所
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N15/34;C12N15/867;C12R1/91
• 代理公司: 鄭州大通專利商標代理有限公司 41111
• 代理人: 張立強

本發明涉及非洲豬瘟病毒技術領域，具體涉及一種提高非洲豬瘟病毒非靶細胞MA?104細胞系感染滴度的方法。將非洲豬瘟病毒的D1133L基因片段插入慢病毒載體中，得到重組慢病毒載體，然后將重組慢病毒轉染MA104細胞系，得到穩定表達D1133L基因的MA?104細胞系MA?104/D1133L，利用該細胞系接種非洲豬瘟病毒，可大大提高非洲豬瘟病毒滴度。感染ASFV后的MA?104/D1133L可以多次收毒。本發明得到的MA?104/D1133L細胞株與野生型MA?104相比，ASFV病毒滴度顯著提高。

技術領域

本發明涉及非洲豬瘟病毒技術領域，具體涉及一種提高非洲豬瘟病毒非靶細胞MA-104細胞系感染滴度的方法。

背景技術

非洲豬瘟病毒（Africanswinefevervirus，ASFV）是一種雙鏈DNA病毒，是唯一的蟲媒DNA病毒，家豬和野豬感染后會引起出血性疾病。自2018年傳入中國，對國內養豬業造成重大的經濟損失。研究表明ASFV編碼50多種結構蛋白和100多種非結構蛋白，其中ASFV編碼五種解旋旋酶，分別為D1133L、Qp509L、Q706L、B962L和A859L，這些蛋白對病毒復制過程中的轉錄階段發揮重要的功能。D1133L基因與牛痘病毒的D6R具有相似的結構域，與病毒轉錄起始相關。

豬肺泡巨噬細胞（PAM細胞）是非洲豬瘟病毒的靶細胞之一，但PAM細胞無法傳代復制，通常獲取PAM細胞是需從豬體內分離新鮮的肺獲得，對于診斷實驗室來說此操作過程耗時耗力，甚至有的診斷實驗室不易獲取PAM細胞。

MA-104屬于非洲綠猴細胞，組織來源于腎細胞，屬于可傳達的上皮樣細胞，MA-104細胞為商業化可以傳代細胞系，可避免獲取原代細胞節省時間。但MA-104細胞為非ASFV感染的靶細胞。申請人前期將ASFV感染MA-104細胞后，ASFV病毒滴度極低。

公開號為CN 103525773A的中國發明專利公開了一種提高豬藍耳病病毒靶細胞感染滴度的方法及其應用，該發明專利采用基因克隆方法從豬肺泡巨噬細胞克隆豬藍耳病病毒受體蛋白基因編碼片段，插入到真核表達載體，通過脂質體介導方式穩定轉染到PRRSV敏感細胞，并采用極限稀釋法，從單個陽性細胞克隆逐步擴繁，建立單個PRRSV 受體或多個PRRSV 受體遺傳修飾的細胞系（株），利用該細胞接種豬藍耳病病毒后，可以大幅提高病毒感染滴度，可以多次收毒，并最終確保所生產PRRSV 疫苗效力的穩定性。由此可以看出，該發明專利采用的仍然病毒的敏感細胞，其通過表達目標病毒的病毒受體來提高病毒感染滴度。

發明內容

本發明提出了一種提高非洲豬瘟病毒非靶細胞MA-104細胞系培養非洲豬瘟病毒時的病毒滴度，以進一步實現利用該可傳代細胞系對非洲豬瘟病毒進行持續培養。

本發明的技術方案為：

一種提高非洲豬瘟病毒非靶細胞MA-104細胞系感染滴度的方法，將非洲豬瘟病毒的D1133L基因片段插入慢病毒載體中，得到重組慢病毒載體，然后將重組慢病毒轉染MA104細胞系進行篩選，得到穩定表達D1133L基因的MA-104細胞系，利用該細胞系接種非洲豬瘟病毒，可顯著提高非洲豬瘟病毒滴度。

具體操作步驟如下：

步驟1：重組慢病毒載體Lv-D1133L構建；

步驟2：包裝慢病毒：

293T細胞消化，接種于10cm皿，包裝慢病毒Lv-D1133L病毒液。終止感染，48小時后收集病毒液，利用0.45μm濾器過濾，然后對慢病毒Lv-D1133L進行病毒液濃縮，-80℃保存備用。

步驟3：慢病毒Lv-D1133L感染MA-104細胞，8小時后終止。

步驟4：篩選培養：利用3μg/mL的puromycin對各組細胞株進行藥篩培養，48小時后更換培養基并傳代，維持培養，收集各組細胞株，提取各組細胞RNA，進行qRT-PCR驗證。篩選得到細胞株MA104/D1133L，D1133L在該細胞株中能夠高效、穩定表達。