[發明專利]一種微滴式數字PCR熒光信號處理方法

在審

• 申請號: 202210025123.5
• 申請日: 2022-01-10
• 公開（公告）號: CN114262733A
• 公開（公告）日: 2022-04-01
• 發明（設計）人: 劉斌劍;劉杰;鐘要齊;鄧新萍;呂才樹;王海;吳林濤
• 申請（專利權）人: 深圳麥科田生物醫療技術股份有限公司
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;G16B5/00;G16B40/30
• 代理公司: 杭州宇信聯合知識產權代理有限公司 33401
• 代理人: 王健

本發明公開了一種微滴式數字PCR熒光信號處理方法，包括：對原始熒光信號進行濾波得到第一熒光信號；基于第一熒光信號識別微滴參數；基于微滴參數和預設微滴過濾條件過濾微滴；對過濾后的微滴進行聚類從而得到第一閾值；基于第一閾值統計陰性微滴和陽性微滴的個數，并計算待測物的濃度。本發明提出的一種微滴式數字PCR熒光信號處理方法，可以準確地從熒光信號中提取出微滴信號、并準確的區分陰性微滴和陽性微滴，從而實現了樣品濃度的準確計算。

技術領域

本發明涉及一種PCR分析技術，具體的涉及一種微滴式數字PCR熒光信號處理方法。

背景技術

聚合酶鏈式反應(Polymerase Chain Reaction，PCR)是80年代中期發展起來的體外核酸擴增技術，具有特異性強、靈敏度高、操作簡便、省時等特點。它可用于基因分離、克隆和核酸序列分析等基礎研究。數字PCR是近年來發展迅速的新一代定量PCR分析技術，利用微流控技術將大量稀釋后的核酸溶液分散至芯片的微反應器中，每個反應器的核酸模板數少于或者等于1個。這樣經過PCR循環之后，有至少一個核酸分子模板的反應器就會給出熒光信號，沒有模板的反應器就沒有熒光信號。根據相對比例和反應器的體積，就可以推算出原始溶液的核酸濃度。與傳統的熒光定量PCR相比，具有高靈敏度、高特異性、無需標準定量曲線等優點。將液滴微流控技術應用在生化分析領域，常使用熒光標記感興趣的細胞或分子，通過識別帶熒光液滴檢測樣品中待測物濃度。因此準確地從熒光信號中提取出微滴信號、并準確的區分陰性微滴和陽性微滴至關重要。

發明內容

本發明提供了一種微滴式數字PCR熒光信號處理方法，可以準確的從熒光信號中提取微滴信號，準確的區分陰性微滴和陽性微滴，從而實現了樣品濃度的準確計算。

本發明克服其技術問題所采用的技術方案是：本發明提出的一種微滴式數字PCR熒光信號處理方法，包括對原始熒光信號進行濾波得到第一熒光信號；基于第一熒光信號識別微滴參數；基于微滴參數和預設微滴過濾條件過濾微滴；對過濾后的微滴進行聚類從而得到第一閾值；基于第一閾值統計陰性微滴和陽性微滴的個數，并計算待測物的濃度。

進一步的，所述對原始熒光信號進行濾波得到第一熒光信號，具體包括：基于預設采樣數量采集原始熒光信號，若采集得到的信號的標準差大于預設標準差閾值，則采用小波濾波器對原始熒光信號進行濾波得到第一熒光信號，若采集得到的信號的標準差小于等于預設標準差閾值，則采用高斯濾波器對原始熒光信號進行濾波得到第一熒光信號。

進一步的，所述基于第一熒光信號識別微滴參數，具體包括：對第一熒光信號進行本底估計得到本底值；基于預設偏差和本底值進行第一熒光信號波峰定位；基于波峰確定微滴熒光強度和波峰距離，從而得到至少包括微滴體積和微滴間距的微滴參數。

進一步的，所述對第一熒光信號進行本底估計得到本底值，具體包括：構建第一熒光信號數據的第一直方圖；將直方圖中最大的頻數對應的熒光強度值作為本底信號的熒光強度均值μ，則得到偏差R＝μ-F_min，其中，Fmin為所有熒光強度的最小值；對在[μ-R，μ+R]區間內的熒光數據進行線性擬合得到參數a和b，則位置T處的本底值為F_b＝aT+b。

進一步的，基于預設長度將第一熒光信號分為若干段，對每段的熒光信號分別構建直方圖；對每個直方圖進行平滑處理；將每個直方圖中最大頻數對應的熒光強度值為對應的每段信號的本底值。

進一步的，所述基于預設偏差和本底值進行第一熒光信號波峰定位，具體包括：基于本底值和預設偏差，將第一熒光信號分為若干信號段，每個信號段中的最大值為波峰。

進一步的，還包括對波峰進行曲線擬合，具體包括：基于預設個數N選取波峰位置前后各N個熒光強度值,將取值順序和熒光強度值組成2N+1個坐標點，并進行二次曲線擬合或高斯曲線擬合。