[發明專利]一種具有洗滌劑抗性的普魯蘭酶PulY103B及其應用

在審

• 申請號: 202210022264.1
• 申請日: 2022-01-10
• 公開（公告）號: CN115029336A
• 公開（公告）日: 2022-09-09
• 發明（設計）人: 韓鵬;吳昕堯;吳永民
• 申請（專利權）人: 昆明理工大學
• 主分類號: C12N9/44
• 分類號: C12N9/44;C12N15/56;C11D3/386
• 代理公司: 昆明同聚專利代理有限公司 53214
• 代理人: 蘇蕓蕓

本發明公開了一種具有洗滌劑抗性的普魯蘭酶PulY103B，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，其為Ⅰ型普魯蘭酶，具有洗滌劑抗性，能提高洗滌劑或去污劑的清洗能力，本發明為洗滌劑的增效提供了新的途徑，且本發明普魯蘭酶PulY103B制備簡單，適用于工業化生產和市場推廣應用。

技術領域

本發明屬于基因工程和酶工程技術領域，具體涉及一種來源于巨大芽孢桿菌的具有洗滌劑抗性的普魯蘭酶PulY103B及其應用。

背景技術

淀粉是植物光合作用的產物，其結構中包含直鏈淀粉和支鏈淀粉，作為最原始的貯能物質，淀粉是很重要的多糖，是食品工業中必不可少的原材料。然而由于淀粉中支鏈淀粉含有約4%~5%的α-1,6-糖苷鍵，單一使用α-淀粉酶（水解α-1,4糖苷鍵）無法徹底水解淀粉，影響了淀粉水解度的提高。

普魯蘭酶是一類淀粉脫支酶，能夠專一性水解糖原和支鏈淀粉分支點中的α-1,6-糖苷鍵，切下支鏈淀粉的整個側鏈將其變成直鏈淀粉。根據水解位點的不同，可將普魯蘭酶分為兩種類型，一種是Ⅰ型普魯蘭酶，專一性水解α-1,6-糖苷鍵；另一種是Ⅱ型普魯蘭酶，其同時具有水解α-1,6-糖苷鍵和內切多糖α-1,4-糖苷鍵的能力。普魯蘭酶主要應用于食品行業中，同時在環保、醫療及洗滌行業中也有重要的應用。

因為淀粉的糖化反應過程需要在較高溫度（50~60℃）、酸性條件（pH4.5~5.5）下進行，目前報道的普魯蘭酶大都是以耐酸耐熱為研究熱點，而對于在洗滌劑工業中具有重要應用價值的堿性普魯蘭酶研究報道很少，一般來說，只有那些具有堿穩定性和洗滌劑抗性的普魯蘭酶才能用于洗滌劑行業，目前已報道的堿性耐受的普魯蘭酶中，還未具有優良洗滌劑抗性的酶出現，而沒有此類特性，其活性會在洗滌劑中或在工作環境中很快失活，其功能特性很難得到體現，所以直至目前還未有成功商業化的洗滌劑適用普魯蘭酶。

發明內容

本發明提供了一種來源于巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）Y103的具有洗滌劑抗性的堿性穩定的普魯蘭酶PulY103B，其氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示，核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示，該普魯蘭酶為Ⅰ型普魯蘭酶。

所述巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）Y103在本發明申請日之前已經在非專利文獻中公開過，申請人保證從申請日起二十年內向公眾發放生物材料。

本發明另一目的是將上述具有洗滌劑抗性的普魯蘭酶PulY103B應用在作為洗滌劑添加劑或去污劑添加劑中，該普魯蘭酶PulY103B具有洗滌劑抗性，能提高洗滌劑或去污劑的去污能力。

為了實現本發明的上述目的，本發明提供了如下的技術方案：

1、從巨大芽孢桿菌（Bacillus megaterium）Y103提取基因組DNA，以其DNA為模板，采用引物Pul-F：GGAATTCCATATGACTGGTGATAATAAGTTTCAGG和Pul-R：CCGCTCGAGCGTTTGAAATAAAATAAGAA克隆普魯蘭酶基因pulY103B，構建重組質粒PulY103B-PET23b，構建重組菌株Pul Y103B- pET23b- E. coli BL21（DE3），進行重組蛋白Pul Y103B異源表達；通過Ni-IDA親和層析進行蛋白純化，獲得普魯蘭酶PulY103B；

2、普魯蘭酶PulY103B的活性分析