[發(fā)明專利]一種URAT1人源化小鼠模型的構(gòu)建方法及其應(yīng)用

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• 申請?zhí)枺?/td>: 202210020025.2
• 申請日: 2022-01-07
• 公開（公告）號: CN114214361A
• 公開（公告）日: 2022-03-22
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陳阿鵬;德格晶
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所;中國中醫(yī)科學(xué)院中藥研究所
• 主分類號: C12N15/85
• 分類號: C12N15/85;C12N15/89;C12N15/90;C12N15/113;C12N9/22;A01K67/027;A61K49/00
• 代理公司: 北京乾成律信知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11927
• 代理人: 姚志遠(yuǎn);張梅珍

1.一種URAT1人源化動物模型的構(gòu)建方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

(1)將背景動物細(xì)胞上的URAT1基因替換成人源URAT1基因；以及

(2)使所述人源URAT1基因在所述背景動物細(xì)胞中表達(dá)并產(chǎn)生人源化URAT1蛋白，同時降低或消除所述背景動物細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源URAT1基因的表達(dá)，從而獲得所述URAT1人源化動物模型。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述人源URAT1基因編碼的氨基酸序列選自：

a)所述氨基酸序列如SEQ ID NO：1所示；

b)所述氨基酸序列與SEQ ID NO：1所示氨基酸的序列同一性程度為至少大約為95％、96％、97％、98％或至少99％；

c)由核酸序列編碼的氨基酸序列，所述核酸序列在嚴(yán)格條件下，與編碼SEQ ID NO：1所示的氨基酸的核苷酸序列雜交；

d)所述氨基酸序列與SEQ ID NO：1所示的氨基酸的序列差異不超過5、4、3、2或不超過1個氨基酸；

和/或

e)所述氨基酸序列具有SEQ ID NO：1所示的，包括取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸殘基的氨基酸序列。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述人源URAT1基因的基因序列選自：

a)所述基因編碼權(quán)利要求2中的氨基酸序列；

b)所述基因的CDS編碼序列如SEQ ID NO：2所示；

c)在嚴(yán)格條件下，與SEQ ID NO：2所示的核苷酸雜交的基因序列；

d)與SEQ ID NO：2所示的核苷酸具有至少大約95％、96％、97％、98％或至少99％同一性程度的基因序列；

e)編碼氨基酸的基因序列，所述氨基酸與SEQ ID NO：1所示的氨基酸的同一性程度為至少大約95％、96％、97％、98％或至少99％；

f)編碼氨基酸的基因序列，所述氨基酸的序列與SEQ ID NO：1的差異不超過5、4、3、2或1個氨基酸殘基；

和/或

g)編碼氨基酸的基因序列，所述氨基酸具有SEQ ID NO：1所示的，包括取代、缺失和/或插入一個或多個氨基酸的氨基酸序列。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的構(gòu)建方法，其特征在于，降低或消除所述背景動物細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源URAT1基因的表達(dá)是通過替換所述背景動物細(xì)胞內(nèi)的內(nèi)源URAT1基因的外顯子1的中間序列而實(shí)現(xiàn)的；

優(yōu)選地，所述背景動物為嚙齒類動物；

更優(yōu)選地，所述嚙齒類動物為小鼠、大鼠或倉鼠；

又優(yōu)選地，所述嚙齒類動物為C57BL品系小鼠；

特別優(yōu)選地，所述小鼠為C57BL/6小鼠；

尤其優(yōu)選地，所述細(xì)胞為受精卵細(xì)胞。

5.根據(jù)權(quán)利要求1至4中任一項(xiàng)所述的構(gòu)建方法，其特征在于，使用基因編輯技術(shù)進(jìn)行所述URAT1人源化動物模型的建立；

優(yōu)選地，所述基因編輯技術(shù)為基因同源重組技術(shù)、CRISPR/Cas9技術(shù)、鋅指核酸酶技術(shù)、轉(zhuǎn)錄激活子樣效應(yīng)因子核酸酶技術(shù)和/或歸巢核酸內(nèi)切酶技術(shù)；

更優(yōu)選地，使用CRISPR/Cas9技術(shù)進(jìn)行所述URAT1人源化動物模型的建立。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的構(gòu)建方法，其特征在于，所述CRISPR/Cas9技術(shù)包括以下步驟：

(1)提供包括人源URAT1基因打靶載體、sgRNA表達(dá)載體以及Cas9的混合物，其中所述Cas9包括Cas9 mRNA和/或Cas9蛋白；

(2)將所述混合物顯微注射至所述背景動物細(xì)胞中；

(3)將所述背景動物細(xì)胞轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)液中進(jìn)行培養(yǎng)之后移植至假孕雌性背景動物體內(nèi)；以及

(4)F0代背景動物的鑒定和篩選；

優(yōu)選地，使用In-Fusion技術(shù)構(gòu)建所述人源URAT1基因打靶載體。