[發(fā)明專利]一種多能干細胞誘導(dǎo)為神經(jīng)祖細胞培養(yǎng)擴增方法及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210018608.1
• 申請日: 2022-01-08
• 公開（公告）號: CN114438020A
• 公開（公告）日: 2022-05-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 楊穎;章征保;李慶;黃志彪;羅振奎;陳美芬;張秋歡;梁揚盛;彭寶瑩
• 申請（專利權(quán)）人: 廣東省疾病預(yù)防控制中心
• 主分類號: C12N5/074
• 分類號: C12N5/074;C12N5/079;C12Q1/02
• 代理公司: 重慶以知共創(chuàng)專利代理事務(wù)所(普通合伙) 50226
• 代理人: 高建華

本發(fā)明屬于細胞生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，提出了一種多能干細胞誘導(dǎo)為神經(jīng)祖細胞培養(yǎng)擴增方法及其應(yīng)用，包括如下步驟：S1:使用預(yù)冷槍頭將Matrigel吸取，加入至預(yù)冷的Advanced DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋，制成Matrigel包被液，并將Matrigel包被液預(yù)冷；S2:將預(yù)冷Matrigel包被液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，并放置于培養(yǎng)箱中靜置，得Matrigel包被培養(yǎng)皿；S3:將融合度達到70?80％的NPC細胞，使用PBS洗滌，再使用Accutase消化酶進行消化；S4:將離心管中的細胞離心去上清，采用NPC維持培養(yǎng)基并加入ROCK inhibitor重懸NPC細胞后接種于Matrigel包被培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)；S5:1天后吸棄Matrigel包被培養(yǎng)皿中液體，并觀察NPC細胞形態(tài)。本發(fā)明神經(jīng)祖細胞來源于誘導(dǎo)人多能干細胞的定向分化，具有人源神經(jīng)祖細胞的形態(tài)和特征，并且實現(xiàn)了該細胞的長期維持培養(yǎng)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于細胞生物學(xué)技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種多能干細胞誘導(dǎo)為神經(jīng)祖細胞培養(yǎng)擴增方法及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

動物替代試驗方法應(yīng)用是目前國際上化學(xué)品安全性評價的一種趨勢和策略，可以減少實驗動物使用、降低花費、縮短時間和提高評價效率等。化學(xué)品安全涉及食品、環(huán)境和職業(yè)安全等領(lǐng)域，環(huán)境化學(xué)物污染、職業(yè)環(huán)境化學(xué)物超標、食品安全和環(huán)境相關(guān)健康問題等已成為目前社會經(jīng)濟發(fā)展的重大問題。歐盟、美國和日本是研究開發(fā)替代實驗方法起步最早的幾個國家，陸續(xù)建立各自的替代實驗方法研究中心，如ECVAM(歐盟動物替代方法研究中心)、ICCVAM(美國替代方法部門間協(xié)調(diào)驗證中心)和JaCAM(日本動物替代方法研究中心)。隨后韓國、加拿大、巴西等國陸續(xù)成立替代方法研究中心。目前已有大量的替代方法經(jīng)過開發(fā)驗證，極大的減少了動物的使用和評價速度。

人類大腦是動物世界中迄今為止最先進、最復(fù)雜的。目前基于嚙齒類動物進行的(DNT)所獲取的化學(xué)物毒性資料值得懷疑，并且評估過程中涉及大量動物的使用，需要花費大量的成本和時間。到目前為止只有12種化學(xué)品被歸類為人類發(fā)育神經(jīng)毒物。因此迫切需要開發(fā)一種快速、成本效益高的標準化DNT替代方法。

人源干細胞如胚胎干細胞、多能干細胞、誘導(dǎo)多能干細胞、神經(jīng)祖細胞等由于具有分化成為各種類型神經(jīng)細胞的潛能，具有開發(fā)高通量檢測的潛能且不存在物種之間外推的問題，因此被認為是開發(fā)DNT體外檢測方法的首選細胞模型。在過去的15年中，人們一直在努力建立、科學(xué)驗證和建立DNT體外評價的試驗方法，已經(jīng)取得了階段性進展。目前研究者根據(jù)神經(jīng)發(fā)育的各個階段，采用不同發(fā)育階段的人源干細胞模型建立一系列體外檢測方法，這些方法檢測終點包括神經(jīng)增殖、細胞凋亡、遷移、神經(jīng)元分化、神經(jīng)節(jié)形態(tài)、神經(jīng)電生理以及神經(jīng)網(wǎng)路等。然而到目前為止，尚未有一種標準的可用于神經(jīng)發(fā)育毒性評價的細胞模型。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明旨在克服背景技術(shù)中的問題，提供一種多能干細胞誘導(dǎo)為神經(jīng)祖細胞培養(yǎng)擴增方法及其應(yīng)用，該神經(jīng)祖細胞來源于誘導(dǎo)人多能干細胞的定向分化，具有人源神經(jīng)祖細胞的形態(tài)和特征，并且實現(xiàn)了該細胞的長期維持培養(yǎng)，并可以將該細胞應(yīng)用于神經(jīng)發(fā)育毒性的體外檢測。

為達到上述目的，本發(fā)明采用如下技術(shù)方案：一種多能干細胞誘導(dǎo)為神經(jīng)祖細胞培養(yǎng)擴增方法，包括如下步驟：

S1:使用槍頭將Matrigel吸取，加入至預(yù)冷的Advanced DMEM/F12培養(yǎng)基稀釋，制成Matrigel包被液，并將Matrigel包被液預(yù)冷；

S2:將預(yù)冷Matrigel包被液轉(zhuǎn)移至培養(yǎng)皿中，并放置于培養(yǎng)箱中靜置，得Matrigel包被培養(yǎng)皿；

S3:將融合度達到70-80％的NPC細胞，使用PBS洗滌，再使用Accutase消化酶進行消化，之后采用PBS進行沖洗轉(zhuǎn)入離心管中；

S4:將離心管中的細胞離心去上清，采用NPC維持培養(yǎng)基并加入ROCK inhibitor重懸細胞后，接種于Matrigel包被培養(yǎng)皿中進行培養(yǎng)；