[發(fā)明專利]一種利用甘露糖合成2′-巖藻糖基乳糖的重組大腸桿菌及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202210018189.1
• 申請(qǐng)日: 2022-01-07
• 公開（公告）號(hào): CN114276971A
• 公開（公告）日: 2022-04-05
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李慶剛;李玉;李浩正;鄭艷玲;宗劍飛;肖衛(wèi)華;彭則濤;程亞楠;李暢;路福平
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 天津科技大學(xué);山東合成遠(yuǎn)景生物科技有限公司
• 主分類號(hào): C12N1/21
• 分類號(hào): C12N1/21;C12N15/53;C12N15/54;C12N15/56;C12N15/60;C12N15/61;C12N15/31;C12P19/24;C12P19/18;C12P19/00;C12R1/19
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 11617
• 代理人: 栗華楠

本發(fā)明涉及一種構(gòu)建重組大腸桿菌利用甘露糖合成GDP?巖藻糖，進(jìn)而生產(chǎn)2′?巖藻糖基乳糖并提高甘露糖利用率的方法，屬于微生物代謝工程領(lǐng)域。所述工程菌以大腸桿菌為出發(fā)菌株，敲除lac操縱子序列中P_lac啟動(dòng)子序列以及l(fā)acI、lacZ基因，并且在1acI、lacZ基因位點(diǎn)上過表達(dá)wcaG、gmd、lacy基因，之后在基因組上敲除磷酸甘露糖異構(gòu)酶編碼基因manA，過表達(dá)磷酸甘露糖變位酶編碼基因manB、α?(1,2)?巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶編碼基因futC、甘露糖?1?磷酸鳥嘌呤基轉(zhuǎn)移酶編碼基因manC所得。本發(fā)明提供的2′?巖藻糖基乳糖從頭合成途徑生產(chǎn)2′?巖藻糖基乳糖的發(fā)酵策略，能夠大幅提高大腸桿菌發(fā)酵生產(chǎn)2′?巖藻糖基乳糖碳源利用率。

技術(shù)領(lǐng)域：

本發(fā)明涉及一種產(chǎn)2′-巖藻糖基乳糖重組大腸桿菌的構(gòu)建方法，該菌種具有提高的甘露糖利用效率，屬于微生物代謝工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)：

母乳低聚糖(HMO)是一類獨(dú)特的、天然存在于母乳中的碳水化合物，對(duì)人體健康有諸多益處，目前，人們將重點(diǎn)放在它作為食品添加劑的應(yīng)用上。

2′-巖藻糖基乳糖(2′-FL)是一種占比最大的母乳低聚糖(HMO)產(chǎn)品(約占31％)，其在腸道中可被有益微生物菌群利用，調(diào)節(jié)腸道微生物；并且在嬰兒奶粉中加入2′-FL可以增強(qiáng)新生嬰兒的免疫力，有效的增強(qiáng)新生嬰兒體質(zhì)；2′-FL在大腦發(fā)育、神經(jīng)元傳遞和突觸的形成中也起作用，所以在飲食中添加2′-FL可以促進(jìn)大腦發(fā)育并且能夠改善學(xué)習(xí)和記憶能力。目前，2′-FL主要用于生產(chǎn)嬰兒配方奶粉、功能食品和飲料，也可以用做食品添加劑，所以直接合成2′-FL具有良好的前景。

目前，合成2′-FL的方法主要有化學(xué)合成法和生物合成法。化學(xué)合成需要對(duì)2′-FL進(jìn)行重復(fù)且多次的保護(hù)和去保護(hù)，過程非常繁瑣，這會(huì)降低產(chǎn)率并且增加成本。利用微生物進(jìn)行2′-FL 的合成，是目前大范圍生產(chǎn)2′-FL可行的方法，而且與化學(xué)合成方法相比，生物合成方法更加安全快捷，合成過程中不用引入大量的有毒試劑，這樣大大增加了產(chǎn)物的安全性。但是目前利用生物合成的方法合成的2′-FL培養(yǎng)基中的主要使用甘油或者葡萄糖為碳源轉(zhuǎn)化成GDP- 巖藻糖，進(jìn)而合成2′-FL的轉(zhuǎn)化率普遍不高。目前微生物生產(chǎn)2′-巖藻糖基乳糖主要有兩條代謝途徑，分別是從頭合成途徑和補(bǔ)救途徑(圖1)。從頭合成途徑主要是從胞內(nèi)代謝物6-磷酸果糖開始，通過manA(磷酸甘露糖異構(gòu)酶)、manB(磷酸甘露糖變位酶)，manC(甘露糖-1- 磷酸鳥嘌呤基轉(zhuǎn)移酶)，gmd(GDP-甘露糖-6-脫氫酶)和wcaG(GDP-巖藻糖合成酶)的順序作用合成GDP-巖藻糖，進(jìn)一步經(jīng)過futC(α-(1,2)-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶)的作用，以GDP-巖藻糖和乳糖為底物，合成2′-巖藻糖基乳糖。補(bǔ)救途徑是經(jīng)過巖藻糖1-激酶/GDP-巖藻糖焦磷酸化酶(Fkp) 的作用，將巖藻糖轉(zhuǎn)化為GDP-巖藻糖，進(jìn)一步經(jīng)過futC(α-(1,2)-巖藻糖基轉(zhuǎn)移酶)的作用，以GDP-巖藻糖和乳糖為底物，合成2′-巖藻糖基乳糖。

補(bǔ)救途徑需要以巖藻糖為碳源生產(chǎn)2′-巖藻糖基乳糖，由于使用巖藻糖為碳源成本過高，基本不具備工業(yè)生產(chǎn)的潛力，而2′-巖藻糖基乳糖的從頭合成途徑，能夠利用甘油或者葡萄糖為碳源合成GDP-巖藻糖進(jìn)而合成2′-巖藻糖基乳糖，具備工業(yè)生產(chǎn)的可能，但由于2′-巖藻糖基乳糖合成途徑弱，難以與糖酵解途徑競(jìng)爭(zhēng)，導(dǎo)致大量碳源被細(xì)胞生長(zhǎng)或代謝消耗，用于生產(chǎn)2′-巖藻糖基乳糖的碳源利用率較低，使2′-巖藻糖基乳糖生產(chǎn)水平較低。

本申請(qǐng)將提供一種利用甘露糖為碳源生成GDP-巖藻糖，進(jìn)而生產(chǎn)2′-FL的方法。

發(fā)明內(nèi)容：