[發(fā)明專利]羅漢果來源糖基轉(zhuǎn)移酶突變體及其應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210015961.4
• 申請日: 2022-01-07
• 公開（公告）號: CN114752577A
• 公開（公告）日: 2022-07-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 李嬌;宋云飛;孫媛霞;李杰;張學(xué)禮;李元元;戴住波
• 申請（專利權(quán)）人: 桂林萊茵生物科技股份有限公司;中國科學(xué)院天津工業(yè)生物技術(shù)研究所
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54
• 代理公司: 廣州海心聯(lián)合專利代理事務(wù)所(普通合伙) 44295
• 代理人: 張栩顏;馬赟齋

本發(fā)明公開了羅漢果來源糖基轉(zhuǎn)移酶突變體，其氨基酸序列具有所述發(fā)生突變的SEQ ID NO:1所示氨基酸序列中的所述突變位點(diǎn)，且與所述發(fā)生突變的氨基酸序列具有80％以上同源性、具有糖基轉(zhuǎn)移酶活性的功能性片段。可以有效催化黃酮類糖基化反應(yīng)，相比于野生型糖基轉(zhuǎn)移酶突變體酶具有較好的區(qū)域選擇性。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物技術(shù)領(lǐng)域，涉及具有不同區(qū)域選擇性的羅漢果來源糖基轉(zhuǎn)移酶突變體及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

天然產(chǎn)物糖基化修飾是植物活性物質(zhì)合成關(guān)鍵步驟。在天然產(chǎn)物糖基化過程中，由于糖基轉(zhuǎn)移酶所能催化的潛在糖基化位點(diǎn)多樣，導(dǎo)致多種糖基化產(chǎn)物的生成，降低了目標(biāo)糖苷的轉(zhuǎn)化率。利用蛋白質(zhì)工程、定點(diǎn)突變的方法對糖基轉(zhuǎn)移酶進(jìn)行改造，得到具有良好的糖基化修飾功能、并能夠用于合成目標(biāo)產(chǎn)物的糖基轉(zhuǎn)移酶突變體對于重要天然化合物的合成與應(yīng)用具有重要的意義。

發(fā)明人從羅漢果中預(yù)測并實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了羅漢果來源的糖基轉(zhuǎn)移酶UGT74AC2在黃酮類(水飛薊賓、山奈酚、白楊素、橙皮素、黃豆苷元、毛蕊異黃酮、鷹嘴豆芽素等)以及含氮或含硫等化合物(4-氨基二苯甲酮、3-氨基二苯甲酮、3,4二氯苯胺、3,4二氯苯硫酚和2,6二氯苯硫酚)中的催化功能，但其專一性催化不理想。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明提供具有不同區(qū)域選擇性的糖基轉(zhuǎn)移酶突變體，可以有效催化黃酮類糖基化反應(yīng)，相比于野生型糖基轉(zhuǎn)移酶突變體酶具有較好的區(qū)域選擇性。

本發(fā)明提供如下技術(shù)方案：

本發(fā)明提供一種糖基轉(zhuǎn)移酶突變體，所述糖基轉(zhuǎn)移酶突變體的氨基酸序列具有所述發(fā)生突變的SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中的所述突變位點(diǎn)，且與所述發(fā)生突變的氨基酸序列具有80％以上同源性的氨基酸序列，優(yōu)選具有90％以上、95％以上或98％以上的同源性。

其氨基酸序列為SEQ ID NO:1所示的氨基酸序列中至少在G11、P12、F88、M119、Y145、T149、L200、V190和Y392位的氨基酸中的至少一個氨基酸殘基發(fā)生突變。作為本發(fā)明的一個實(shí)施方式，突變是指序列中原氨基酸被1個或多個的其他氨基酸殘基取代。

其他氨基酸殘基為丙氨酸、精氨酸、天冬酰胺、天冬氨酸、半胱氨酸、谷氨酰胺、谷氨酸、甘氨酸、組氨酸、異亮氨酸、亮氨酸、賴氨酸、甲硫氨酸、苯丙氨酸、脯氨酸、絲氨酸、蘇氨酸、色氨酸、酪氨酸和纈氨酸中之一。

所述糖基轉(zhuǎn)移酶突變體包括對應(yīng)于SEQ ID NO:1，發(fā)生如下位點(diǎn)的取代：G11Y、Y145F、P12Y、P12G、F88S、M119L、M196L、M119W、L200W、L200F、L200Y、L200M、Y145W、Y392T、V190I、V190W中的任一種或二種以上的組合。優(yōu)選組合突變包括：V190I/M119Q、V190I/L200M、V190I/Y392S、G11Y/Y145F、P12Y/L200W、Y392T/L43A、Y392T/F88M、Y392T/T149V、Y392T/M196N、Y392T/L200M、Y392T/K287Y。

在一個實(shí)施方案中，所述糖基轉(zhuǎn)移酶突變體同時(shí)包括對應(yīng)于SEQ ID NO:1的第11位甘氨酸和第145位酪氨酸的突變，例如位于第11位甘氨酸G突變?yōu)槔野彼醂，同時(shí)第145位酪氨酸Y突變?yōu)楸奖彼酕，該突變體能夠?qū)λw薊賓的C3位羥基和C7位羥基同時(shí)進(jìn)行糖基化修飾形成雙糖基化產(chǎn)物，并且雙糖基化產(chǎn)物的比例能夠達(dá)到99％以上。

在一個實(shí)施方案中，所述糖基轉(zhuǎn)移酶突變體至少包括對應(yīng)于SEQ ID NO:1的第12位脯氨酸P突變?yōu)槔野彼帷⒌?00位亮氨酸L突變?yōu)楸奖彼酕或色氨酸W或第145位酪氨酸Y突變?yōu)樯彼醀；優(yōu)選，所述糖基轉(zhuǎn)移酶突變體包括如下位點(diǎn)的突變：P12Y和L200W，該突變體能夠?qū)λw薊賓的C7位羥基進(jìn)行選擇性糖基化，且選擇性能達(dá)到99％以上。