[發明專利]一種臨床用自然殺傷細胞的制備方法

有效

• 申請號: 202210011909.1
• 申請日: 2022-01-07
• 公開（公告）號: CN114058584B
• 公開（公告）日: 2022-07-01
• 發明（設計）人: 刁小娟;宋芳;孫健;劉照軍;孫旭燕;莊肅靜;雒猛;楊衛娟;王龍;洪凡真
• 申請（專利權）人: 山東省齊魯干細胞工程有限公司
• 主分類號: C12N5/0783
• 分類號: C12N5/0783;C12N5/0789;C12N5/078;C12N5/09
• 代理公司: 北京輕創知識產權代理有限公司 11212
• 代理人: 王東旭

本發明屬于生物醫學技術領域，具體涉及一種臨床用自然殺傷細胞的制備方法，主要包括以下步驟：步驟一、從臍帶血中分選CD34+標記的臍帶血造血干細胞，并獲得剩余單個核細胞；步驟二、剩余單個核細胞成份的優化；步驟三、NK細胞的培養和擴增；步驟四、細胞數量及細胞表型鑒定。本發明首先分離出臍帶血中的自體血漿及單個核細胞，其次利用磁珠法分選出單個核細胞中以CD34+為表面標記的造血干細胞，獲得造血干細胞的同時，也收獲了除造血干細胞以外的剩余成份，用此剩余成份及自體血漿培養NK細胞，實現了資源的合理利用，使得同一份臍帶血既可以進行造血干細胞回輸，又可以培養出符合臨床需求的具有抗腫瘤活性的NK細胞，適于廣泛推廣應用。

技術領域

本發明涉及生物醫學技術領域，具體為一種臨床用自然殺傷細胞的制備方法。

背景技術

異基因造血干細胞移植是根治白血病的重要手段，但移植后白血病復發是困擾移植成功的評分障礙。移植后復發率可高達20%—80%，對于復發的患者治療困難、預后差。二次移植雖可使部分患者再次緩解，但二次移植后相關合并癥的發生率為25%—50%，極大地限制了二次移植的應用。近年來臨床研究顯示，取自原移植供體具免疫活性的淋巴細胞輸注，可使異基因造血干細胞移植后白血病復發患者再次緩解，并且療效好、毒性小。這種供者淋巴細胞輸注可能成為新的預防異基因造血干細胞移植后白血病復發的策略。

供者淋巴細胞輸注是指通過輸入異基因造血干細胞移植術后供者的淋巴細胞來治療惡性疾病的一種方法。其目標是通過移植物抗腫瘤效應來誘導和維持緩解。其中供者是指為患者提供異基因造血干細胞的人，因骨髓應用受限，目前多指為患者提供臍帶血的人。而在實際應用中，尋找臍帶血的供者比較繁瑣且變數較多，因此有較多的局限性。供者淋巴細胞輸注臨床應用中供者的自然殺傷細胞（Natural Killer Cell , NK）是較為重要的淋巴細胞。NK細胞來源于骨髓，分布于外周血和脾臟，是一類固有免疫細胞，無需抗原預先致敏，且無主要組織相容性復合物（major histocompatibility complex ,MHC）限制性，可直接殺傷腫瘤細胞或被感染的細胞，具有廣譜的抗腫瘤作用，所以NK細胞在抗腫瘤免疫治療中具有巨大的潛力。由于人體自身NK細胞的含量有限，在體外快速擴增獲得大量活化的 NK 細胞是DLI臨床應用的關鍵。

因此為解決現有臍帶血造血干細胞移植后進一步進行供者NK細胞輸注，而供者NK細胞來源獲取局限性的問題，本發明提供了一種臨床用自然殺傷細胞的制備方法，可在體外大量培養進而獲得符合臨床需求的NK細胞。

發明內容

為解決現有臍帶血造血干細胞移植后進一步進行供者NK細胞輸注，而供者NK細胞來源獲取局限性的問題，本發明提出一種臨床用自然殺傷細胞的制備方法，在分選出以CD34+為標記的臍帶血造血干細胞后，進一步優化剩余的單個核細胞，可成功提取到符合臨床需求的安全且高標準的NK細胞。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：

本發明提供一種臨床用自然殺傷細胞的制備方法，包括以下步驟：

步驟一、從臍帶血中分選CD34+標記的臍帶血造血干細胞，并獲得剩余單個核細胞

（1）健康供者的臍帶血，轉入離心管中充分混勻，吸取上層部分獲得自體血漿，備用；

（2）將生理鹽水與血細胞沉淀稀釋，吹打混勻，將混懸液緩慢加到Ficoll層上，室溫1800-2400rpm離心15-20min；

（3）吸出離心后的白膜層，PBS緩沖液重懸，室溫下800-1400rpm離心3-8min，重復兩次；

（4）根據MACS CD34陽性免疫磁珠試劑盒說明書進行CD34+細胞的分選，獲得以CD34+為標記的造血干細胞及剩余的單個核細胞成份；

步驟二、剩余單個核細胞成份的優化