[發明專利]一種提高D-生物素產量的生產方法

在審

• 申請號: 202210011841.7
• 申請日: 2022-01-06
• 公開（公告）號: CN114480525A
• 公開（公告）日: 2022-05-13
• 發明（設計）人: 郭鳳柱;李飛龍;周斌;梅吉雷;李光進;況嘉鈾;江根強;朱勇剛;徐志南;趙佳潤
• 申請（專利權）人: 浙江圣達生物藥業股份有限公司;浙江新銀象生物工程有限公司
• 主分類號: C12P17/18
• 分類號: C12P17/18;C12N1/21;C07D495/04;C12R1/38
• 代理公司: 北京瑞盛銘杰知識產權代理事務所(普通合伙) 11617
• 代理人: 侯思聰

本發明涉及一種提高D?生物素產量的生產方法，屬于生物技術領域。本發明公開了一種提高D?生物素產量的生產方法，該方法是采用易變假單胞菌(Pseudomonas mutabilis)基因工程菌，以葡萄糖和甘油為復合碳源，并采用兩階段或三階段控溫策略，結合乙醇補料工藝進行D?生物素的快速發酵生產，較原始工藝產量提高了21％?170％，周期縮短了13％?28％。本發明提供了一種簡便、安全、高效的D?生物素發酵生產方法，改變了已有生產工藝步驟，顯著提高了D?生物素的生產強度，不僅縮短了發酵周期，節約了成本，而且減少了發酵廢液和廢氣的排放，減輕環境污染，另外，工藝簡單易放大，易于實現工業化生產。

技術領域

本發明屬于發酵工程技術領域，具體地涉及一種生產D-生物素的液體發酵方法的改進方法。

背景技術

生物素(Biotin)屬于水溶性B族維生素，亦稱維生素B₇、維生素H、輔酶 R(Coenzyme R,CoR)，是一種環狀結構的物質，具有硫酚(Thiophene)的結構環，此種化學物質有八種同分異構體，但只有右旋生物素(D-生物素)是存在于自然界的，也只有其有維生素的活性。它是動物、植物和微生物營養的必需維生素之一，是羧化和脫羧化反應的輔酶，是合成維生素C的必要物質，是脂肪和蛋白質正常代謝不可或缺的物質，其在維持人和動物正常生長發育、保護皮膚健康、毛發和骨骼健康等方面起到必不可少的作用。因此，在食品、醫療、多維制劑和飼料添加劑行業得以廣泛應用。據統計，2010-2018年期間，全球生物素需求量從150噸增長到230噸，年復合增長率為5.49％，其中國內需求增速顯著大于國外需求增速。目前，全球市場每年需求量為250噸，并逐年增加?？梢?， D-生物素具有非常廣闊的應用潛力及商業市場前景。

生物素為無色、無臭、長針狀結晶物，在普通溫度下相當穩定，紫外光下逐漸被破壞，易溶于熱水和乙醇中，在弱酸性或弱堿性溶液中較穩定，強酸或強堿中加熱則破壞其生物活性。

當前，商業化的D-生物素，大部分仍以化學合成法為主，且工藝主要以 Sternbach合成路線為基礎，現行的工業化生產方法在此基礎上進行改進。生物素分子結構復雜，具有三個手性中心，合成技術要求高，生產工藝屬不對稱合成，其合成路線長，對反應的要求高，生產難度極大，壁壘高，且從投料到出品需要一個月左右的時間。

經過檢索，截至目前，公布的有關D-生物素制備方法的主要專利有：

1.申請號為85103248的“制備雜環化合物新方法”發明專利，是霍夫曼·拉羅奇有限公司在中國申請的專利，該專利敘述了一種用于制備生物素合成過程中的中間體以及制備生物素本身的方法，在該方法中，通過格利雅反應將側鏈連到環狀體系上，使得到的化合物脫水，然后使脫水產物基本上還原。

2.申請號為87107807.4的“圓球桿菌的bioA,bioD,bioF,bioC,bioH基因的克隆，載體和轉化細胞以及生物素的制備方法”發明專利，是特朗斯吉恩有限公司在中國申請的專利，該專利公開了涉及DNA(脫氧核糖核酸)順序，它是下列的在細菌中的生物素的生物合成鏈的基因之一：bioA,bioD,bioF,bioC和bioH基因；包含這些順序的載體能夠轉化其它的微生物，以便改進生物素的生產。

3.專利號為ZL 91103221.5的“新的微生物以及利用這些微生物生產生物素同效維生素的方法”的發明專利，是資生堂株式會社在中國申請的專利，該專利公開了一種屬于埃希氏桿菌屬，芽孢桿菌屬和賽氏桿菌屬中任一屬的突變菌株，該菌株具有的葡萄糖消耗速率至多為相應野生型菌株的四分之一，且其中的生物素反饋抑制途經已去除。該發明還提供了利用該突變菌株生產生物素的方法。

4.申請號為93102377.7的“新的微生物和用所述微生物制備d-生物素的方法”的發明專利，是田邊制藥株式會社在中國申請的專利，該專利公開了一種新的微生物，其是通過導入摻有沙雷氏菌屬的生物素基因的重組質粒并進一步將外源生物素基因整合到染色體中所獲得的，以及用所獲得的微生物制備d-生物素的方法，包括在培養基中培養微生物并積累d-生物素，最后收集d-生物素。