[發(fā)明專利]分離的雙加氧酶及其編碼基因與應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202210011773.4
• 申請日: 2022-01-06
• 公開（公告）號: CN114438045A
• 公開（公告）日: 2022-05-06
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 高偉;王家典;吳曉毅;王榮鳳
• 申請（專利權(quán)）人: 首都醫(yī)科大學(xué)
• 主分類號: C12N9/02
• 分類號: C12N9/02;C12N15/53;C12N15/70;C12N1/21;C12P15/00;C12R1/19
• 代理公司: 北京天奇智新知識產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11340
• 代理人: 陸軍

本發(fā)明涉及一種分離的酶，為一種α?酮戊二酸依賴型雙加氧酶，可催化對映?貝殼杉烯酸的C?2位羥化生成2?羥基對映貝殼杉烯酸，本發(fā)明還涉及編碼所述酶的基因，包含所述基因的表達(dá)載體、以及含有表達(dá)載體的重組工程菌，可用于2?羥基對映貝殼杉烯酸的生產(chǎn)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及一種分離的α-酮戊二酸依賴型雙加氧酶Tw2ODD5及其編碼基因，可催化對映-貝殼杉烯酸C-2位羥化，屬于藥用植物基因工程領(lǐng)域。

背景技術(shù)

雷公藤(Tripterygium wilfordii Hook.f.)是傳統(tǒng)中藥雷公藤的植物來源，具有清熱解毒，祛風(fēng)除濕，殺蟲止癢，消腫散結(jié)等功效(高偉,劉夢婷,程琪慶,等.雷公藤的本草考證[J].世界中醫(yī)藥,2012,7(6):560-562.)?，F(xiàn)代研究表明雷公藤可用于風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎,腎小球腎炎,腎病綜合征等病的治療。萜類成分是雷公藤的主要活性成分，貝殼杉烷型二萜是其中的重要組成部分。從中藥的活性成分中開發(fā)新藥是一種很有前景的方式，然而由于植物的生長緩慢且藥用成分含量很低，大大限制了其應(yīng)用。近年來利用合成生物學(xué)技術(shù)設(shè)計和改造微生物菌株來生產(chǎn)天然活性產(chǎn)物已經(jīng)成為一種極具潛力的獲取方法。

萜類化合物在高等植物中的合成途徑主要有兩種，位于細(xì)胞質(zhì)中的MVA途徑和位于質(zhì)體中MEP途徑,通過以上兩個途徑生成萜類的共同前體異戊烯基焦磷酸(IPP)及其同分異構(gòu)體二甲基丙烯基焦磷酸(DMAPP)；在異戊烯轉(zhuǎn)移酶的催化下，生成GGPP前體，再由二萜合酶(Diterpene synthase)催化形成二萜烯中間體母核結(jié)構(gòu)(Su P.*,Gao L.H.*,Liu S.,et al.Probing the function of protein farnesyltransferase in Tripterygiumwilfordii[J].Plant Cell Reports,2019,38(2):211-220)，然后母核在氧化酶、甲基轉(zhuǎn)移酶等后修飾酶的作用下生成復(fù)雜多樣的二萜類活性化合物。

α-酮戊二酸依賴型雙加氧酶(2-oxoglutarate/Fe(II)-dependentdioxygenases,2-ODDs),是一類不含血紅素的單核鐵原子蛋白，與細(xì)胞色素P450單加氧酶相比，2-ODDs反應(yīng)時僅需要2個或者3個配體，因此具有更高的靈活性，其所催化的反應(yīng)更具多樣性和復(fù)雜性(Farrow和Facchini2014)。2-ODDs是一個龐大的基因家族,一般根據(jù)其氨基酸序列BLAST P值分為3個具有明顯差異的亞家族，分別是DOXA、DOXB和DOXC(Kawai等2014)，其中DOXA和DOXB調(diào)控植物關(guān)鍵的生長發(fā)育過程,如初生代謝、多肽鏈的翻譯后修飾等，在數(shù)量和蛋白序列上具有較高的保守性。DOXC亞家族參與植物的次生代謝,包括酚酸類,生物堿類以及萜類成分等,它在不同植物體內(nèi)數(shù)量和功能差異較大,具有較大的物種間特異性(Kawai等2014)。這三類2-ODDs在植物界中廣泛存在,可以催化羥基化反應(yīng)、去甲基化反應(yīng)、開環(huán)反應(yīng)、去飽和反應(yīng)、閉(成)環(huán)反應(yīng)和鹵化反應(yīng)等(Islam等2018)。

張逸風(fēng)等人成功鑒定了雷公藤中的首個α-酮戊二酸依賴型雙加氧酶TwGA13ox,，體外酶促研究證實其可以催化赤霉素A9的C13位發(fā)生氧化，生成赤霉素A20。本發(fā)明從雷公藤懸浮細(xì)胞中克隆得到一條α-酮戊二酸依賴型雙加氧酶基因Tw2ODD5。通過體外酶促反應(yīng)驗證其皆具有催化對映-貝殼杉烯酸(ent-kauranoic acid，縮寫KA)的C2位發(fā)生氧化生成相應(yīng)羥化產(chǎn)物的功能。該基因是從雷公藤中首次克隆得到的，在本發(fā)明被公布之前，尚未有任何公開或報道過本專利申請中所提及的雷公藤2ODD酶基因及其氨基酸序列。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明的第一方面，提供了一種分離的酶，所述酶參與二萜類化合物的生物合成，尤其是貝殼杉烷型二萜類化合物，如2-羥基對映貝殼杉烯酸。