[發明專利]蚯蚓綜合提取的方法

在審

• 申請號: 202210005972.4
• 申請日: 2022-01-05
• 公開（公告）號: CN114315953A
• 公開（公告）日: 2022-04-12
• 發明（設計）人: 鄂盟;張怡風
• 申請（專利權）人: 鄂盟;張怡風
• 主分類號: C07K1/14
• 分類號: C07K1/14;C12N9/02;C12N9/68;C12N9/64;C11B1/02;C05F15/00;C05F17/20;C05F17/50
• 代理公司: 北京雙收知識產權代理有限公司 11241
• 代理人: 竇志梅

1.一種蚯蚓綜合提取的方法，其特征在于：它包括以下步驟：

(1)漿化

將從冷庫中取出的蚯蚓在室溫下解凍，然后送入分離式磨漿機進行漿化處理，得到漿化液，漿化液的顆粒≤100μm；

(2)酶解

上述漿化液與純凈水以1:1的比例混合，得到蚯蚓混合液，將上述蚯蚓混合液送入酶解罐進行酶解，酶解是蚯蚓混合液在45℃—55℃下，依靠自身中所含酶的自溶特性進行溶解的過程，在酶解過程中，每隔30分鐘攪拌一次，每次攪拌3分鐘，酶解時間為3小時，得到酶解液，然后將所得到的酶解液送0—10℃的冷庫中進行冷卻，使得酶解液的溫度降到15℃以下；

(3)三相分離

將上述酶解液送入蝶式離心機進行三相分離，從蝶式離心機的固渣出口排出的固渣和蚯蚓糞以1:1混合進行好氧發酵堆肥，經過1—3天堆溫升至55℃-70℃，并保持時間4—7天，然后二次自然堆放20-40天后得到合格的有機肥；從蝶式離心機的油脂出口排出的油脂在75℃至85℃的溫度下，經過油水分離器進行油水分離后，得到蚯蚓粗油脂，粗油脂的收率為蚯蚓重量比的2.1％，水分≤0.1％；從蝶式離心機的清液出口排出的離心液送入步驟(4)中；

(4)二相分離

上述離心液通過連接管道內的紫外線殺菌后，送入高速管式分離機進行分離，在高速管式分離機的轉鼓壁上緊貼有聚四氟乙烯漆布，隨著高速管式分離機的轉鼓的高速旋轉，離心液中比重較大的固體在離心力的作用下留到了聚四氟乙烯漆布上，比重較小的離心液從高速管式分離機的清液出口流出得到的清液，清液經由連接管道內的紫外線殺菌后，進入步驟(5)，離心完成后，抽出聚四氟乙烯漆布，清洗轉鼓，用專用刮刀將聚四氟乙烯漆布上的固體刮掉后，送入第四真空干燥箱中進行真空干燥，干燥后的固體即為地龍蛋白；

(5)澄清

從步驟(4)中得到的清液送入澄清膜組件中進行澄清，澄清膜組件為120K中空纖維的內壓管式膜組件，在一定的壓力下，從中空纖維膜絲孔內透過絲壁到孔外的液體為澄清液，澄清液送入步驟(6)中，未透過超濾膜絲絲壁表面的液體從澄清膜組件的濃液出口流出，經過懸浮物檢測儀檢測溶液濃度后，再次返回澄清膜組件中進行澄清，當懸浮物檢測儀檢測到的溶液濃度達到55—65g/L時，從上述濃液出口流出的濃液返回到步驟(2)的酶解罐中；

(6)濃縮

從步驟(5)中得到的澄清液送入超濾濃縮膜組件中進行濃縮,超濾濃縮膜組件為5K中空纖維的內壓管式膜組件，在一定的壓力下，從中空纖維膜絲孔內透過絲壁到孔外的液體為清液，清液送入步驟(7)中，未透過上述絲壁的液體從超濾濃縮膜組件的濃液出口流出，經過懸浮物檢測儀檢測溶液濃度后，再次返回超濾濃縮膜組件中進行濃縮，當懸浮物檢測儀檢測到的溶液濃度達到45-55g/L時，從上述濃液出口流出的濃液送入步驟(8)中；濃液中的蚓激酶含量至少為562500u/ml，超氧化物歧化酶含量至少為27080u/ml；

(7)納濾濃縮

從步驟(6)中得到的清液送入納濾濃縮膜組件中進行濃縮，在一定的壓力下，透過納濾濃縮膜表面的液體為清液，該清液送入污水收集箱中進行污水處理，未透過納濾濃縮膜表面的液體從納濾濃縮膜組件的濃液出口流出，經過懸浮物監測儀檢測溶液濃度后，再次返回納濾濃縮膜組件中進行濃縮，當懸浮物監測儀檢測到的溶液濃度達到45-55g/L時，從納濾濃縮膜組件的濃液出口流出的濃液送入第一真空冷凍干燥機中進行冷凍干燥，得到復合氨基酸；

(8)層析，它包括以下步驟：

(a)柱平衡

分別用體積為柱床體積的1.5倍的200mmoL/L的磷酸鹽緩沖液，和體積為柱床體積的2倍的5mmol/L磷酸鹽緩沖液對柱床進行平衡，先將柱床體積的1.5倍的200mmoL/L的磷酸鹽緩沖液送入層析柱中，當液面高于柱床2—3cm時，打開層析柱底下閥門，當200mmoL/L的磷酸鹽緩沖液全部進入層析柱后，關閉層析柱底下的閥門，磷酸鹽緩沖液的流速是3.5L/min，讓200mmoL/L的磷酸鹽緩沖液在柱床中和離子交換劑靜態交換平衡30分鐘；打開關閉的層析柱底下的閥門，以同樣的方式，將體積為柱床體積的2倍的5mmol/L磷酸鹽緩沖液也送入層析柱中，當5mmoL/L的磷酸鹽緩沖液全部進入層析柱后，關閉層析柱底下的閥門，讓5mmoL/L的磷酸鹽緩沖液在柱床中和離子交換劑靜態交換平衡30分鐘，柱平衡完成；

(b)上樣和淋洗

將從步驟(6)濃液出口流出的濃液用食品級NaOH溶液將其pH調到7.8后，立即將其送入柱平衡完成的層析柱中，此過程稱為上樣，當液面高于柱床2—3cm時，打開層析柱底下閥門，繼續上樣，上樣流速為2.5L/分鐘，上樣完成后，關閉層析柱底下的閥門，讓柱床中的濃液和交換劑靜態平衡交換30分鐘，然后打開層析柱底下閥門，再用體積為柱床體積的1.5倍的5mmoL/L的磷酸鹽緩沖液對上述層析柱進行淋洗，排出沒有和交換劑進行交換的雜蛋白，關閉層析柱底下閥門；

(c)洗脫

洗脫是用體積為柱床體積的5倍的含有0.6mol/L的NaCl溶液，且該溶液是含有5mmol/L的磷酸鹽緩沖液，將吸附在交換劑上的超氧化物歧化酶和蚓激酶洗脫下來，洗脫液的流速是3.5L/min，打開層析柱底下閥門將上述洗脫液分別進行收集處理，當出水管中流出的洗脫液為亮藍綠色時開始收集，此時收集的液體為超氧化物歧化酶洗脫液，進入步驟(9)；之后，流出的液體變為棕褐色，此時收集的液體為蚓激酶洗脫液，進入步驟(10)，當液體變為橘黃色或淡黃色時洗脫結束；超氧化物歧化酶洗脫液中SOD含量至少為19500u/ml，蚓激酶洗脫液中的蚓激酶含量至少為120000u/ml；超氧化物歧化酶的收率為71％，蚓激酶的收率為80％；

(9)超氧化物歧化酶洗脫液的濃縮和脫鹽

從步驟(8)得到的超氧化物歧化酶洗脫液送入第一濃縮脫鹽膜組件的超濾濃縮管式膜中進行濃縮，超濾濃縮管式膜為5K中空纖維的內壓管式膜組件，在一定的壓力下，從內到外透過中空纖維膜膜絲表面的透過液為清液，清液送入污水收集箱中進行污水達標處理，未透過的洗脫液從超濾濃縮管式膜的濃液出口流出，經過懸浮物監測儀檢測溶液濃度后，再次返回超濾濃縮管式膜中進行濃縮，當懸浮物監測儀檢測到的溶液濃度達到20—30g/L時，從超濾濃縮管式膜的濃液出口流出的濃液送入清水混合器中，在清水混合器中加入與濃液相同體積的純凈水量，清水混合器的出口與超濾濃縮管式膜進口相連，溶液再次進入上述超濾濃縮管式膜進行循環濃縮，從超濾濃縮管式膜的濃液出口流出的濃液在清水混合器中加入了4-6次純凈水后，并且當裝在清水混合器進口的管道上的懸浮物監測儀檢測到的溶液濃度達到20—30g/L時，從超濾濃縮管式膜的濃液出口流出的濃液送入第二真空冷凍干燥機中進行冷凍干燥，得到超氧化物歧化酶；

(10)蚓激酶洗脫液的濃縮和脫鹽

從步驟(8)得到的蚓激酶洗脫液送入第二濃縮脫鹽膜組件的超濾濃縮管式膜中進行濃縮，超濾濃縮管式膜為5K中空纖維的內壓管式膜組件，在一定的壓力下，從內到外透過中空纖維膜膜絲表面的洗脫液為清液，清液送入污水收集箱中進行污水達標處理，未透過的洗脫液從超濾濃縮管式膜的濃液出口流出，經過懸浮物監測儀檢測溶液濃度后，再次返回超濾濃縮管式膜中進行濃縮，當懸浮物監測儀檢測到的溶液濃度達到45—55g/L時，從超濾濃縮管式膜的濃液出口流出的濃液送入清水混合器中，在清水混合器中加入與濃液相同體積的純凈水量，清水混合器的出口與超濾濃縮管式膜進口相連，溶液再次進入上述超濾濃縮管式膜進行循環濃縮，從超濾濃縮管式膜的濃液出口流出濃液在清水混合器中加入了4-6次水后，并且當裝在清水混合器進口的管道上的懸浮物監測儀檢測到的溶液濃度達到45—55g/L時，從超濾濃縮管式膜的濃液出口流出的濃液送入第三真空冷凍干燥機中進行冷凍干燥，得到蚓激酶。