[發明專利]鞭毛素突變體與非洲豬瘟抗原的融合蛋白及其應用

有效

• 申請號: 202210005158.2
• 申請日: 2022-01-05
• 公開（公告）號: CN114292339B
• 公開（公告）日: 2022-08-09
• 發明（設計）人: 鄒忠;左文峰;金梅林;康超;楊于;尚霄敏;黎晶晶;楊麗;孫小美;何興林
• 申請（專利權）人: 武漢科前生物股份有限公司;華中農業大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N15/70;A61K39/12;A61P31/20
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所(普通合伙) 42001
• 代理人: 龔瑩瑩

本發明屬于生物技術領域，公開了了鞭毛素突變體與非洲豬瘟抗原的融合蛋白及其應用。本發明將非洲豬瘟保護性抗原與鞭毛素突變體融合，能夠大量表達和制備。雖然p22、p62抗原的自身免疫原性具有差異，但是融合鞭毛素后，均可以顯著提高抗原p22、p62的黏膜免疫水平，同時由于所構建的鞭毛素突變體能夠在上清中高效表達，融合后有助于p22、p62的上清表達。

技術領域

本發明屬于生物技術領域，具體涉及鞭毛素突變體與非洲豬瘟抗原的融合蛋白及其應用。

背景技術

通過鞭毛素蛋白與目的蛋白混合或融合后免疫，可以提高機體對抗原的免疫應答，其中鞭毛素融合或偶聯抗原免疫效果更為顯著【1】【2】，以鞭毛素為佐劑的核酸疫苗僅在實驗室階段研究，雖然不用經過蛋白純化工藝，但是核酸疫苗本身面臨著不可預知的安全風險和臨床監管；目前很多致病菌的鞭毛素可能具有潛在的危險性和毒性，免疫動物后產生大量針對自身的抗體，導致可能的耐受性及炎癥反應，這主要源于鞭毛素可變區的高免疫原性。沙門氏同種屬的鞭毛素蛋白的氨基及羧基末端比較保守，從結構上可以分為保守的D0，D1,可變區D2和D3區；其中鞭毛素蛋白抗原性很強的區域位于D2和D3區，根據文獻報道，外源抗原通常可以與鞭毛素羧基端連接或插入高可變區(I型鞭毛素174-400位或201-368位)，均保留了鞭毛素TLR5信號通路活性【3、4】。保守D0結構域由N端和C端兩組α螺旋構成，C末端6個氨基酸VLSLLR形成疏水基序Motif，位于鞭毛素內核，亞基間的強疏水相互作用是參與鞭毛素組裝的關鍵驅動力【5、6】。

近年來非洲豬瘟在國內外集約化養豬場的感染率和發病率日益提高，給養殖場帶來巨大的經濟損失。非洲豬瘟(African swine fever，ASF)是由非洲豬瘟病毒(Africanswine fever virus，ASFV)引起的以高熱、皮膚發紺、淋巴及內臟器官嚴重出血為特征的急性、接觸性傳染病，一旦暴發，死亡率接近90-100％。家豬和野豬是該病毒的自然宿主，感染后可終身帶毒。ASFV是一種單股、兩端共價連接的雙鏈DNA病毒，具有二十面體結構，基因組全長約170kb～190kb，主要由4層組成：中央核仁、核衣殼、內層囊膜和二十面體的病毒衣殼，胞外病毒粒子，核衣殼具有雙層囊膜。

研究表明，非洲豬瘟p22和p62等結構蛋白在病毒入侵，衣殼組裝上起到重要作用【7,8,9】以這些蛋白為靶標的核酸疫苗及活載體疫苗均能一定程度上抑制非洲豬瘟在肺泡巨噬細胞(PAM)上的復制和增殖，降低帶毒量，延緩病情的發作。非洲豬瘟病毒的傳播途徑糞口傳播，在唾液和扁導體的分離率很高。因此，提高粘膜免疫對于非洲豬瘟的防控具有積極意義。

因此本發明從發現最小的腸道沙門氏鞭毛素(WP_050188722)進行設計突變，與非洲豬瘟抗原融合表達，以期提高豬群對靶抗原的黏膜免疫效果。

發明內容

本發明的目的是提供鞭毛素突變體與非洲豬瘟抗原的融合蛋白，所述的融合蛋白是將鞭毛素突變體于非洲豬瘟P22或P62蛋白進行融合，制備的融合蛋白Fm-p22的氨基酸序列為SEQ ID NO.12所示，Fm-p62的氨基酸序列為SEQ ID NO.13所示。

本發明的另一個目的在于提供鞭毛素突變體與非洲豬瘟抗原的融合蛋白在制備疫苗非洲豬瘟疫苗中的應用。

為了達到上述目的，本發明采取以下技術措施：