[發明專利]一種利用大腸桿菌制備牛肌紅蛋白的方法

在審

• 申請號: 202180008690.3
• 申請日: 2021-01-09
• 公開（公告）號: CN114945591A
• 公開（公告）日: 2022-08-26
• 發明（設計）人: 尹成俊;姜尚鉉;全秀娟;權安成;李恩吉
• 申請（專利權）人: 尹特榮生物科技株式會社
• 主分類號: C07K14/805
• 分類號: C07K14/805;C12N15/70;C12N9/10;C12N9/04;C12N9/88;A23L27/00;A61K38/42;A61P7/06;A23L33/18
• 代理公司: 北京德崇智捷知識產權代理有限公司 11467
• 代理人: 金星

1.一種制備牛肌紅蛋白的方法，包括：

構建含有用于血紅素生物合成途徑酶的基因的第一質粒；

構建含有用于牛肌紅蛋白MYG的基因的第二質粒；

構建含有第一質粒和第二質粒的第一大腸桿菌生產宿主；

以及通過培養第一大腸桿菌生產宿主生產牛肌紅蛋白。

2.根據權利要求1所述的方法，其中血紅素生物合成途徑酶是ALA合酶、NADP依賴的蘋果酸酶、二羧酸轉運體和亞鐵螯合酶。

3.根據權利要求1所述的方法，其中牛肌紅蛋白由具有如SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的珠蛋白和具有分子式1的血紅素組成，

4.根據權利要求1所述的方法，其中，第一質粒具有SEQ ID NO：6所示的核苷酸序列。

5.根據權利要求1所述的方法，其中，第二質粒具有SEQ ID NO：8所示的核苷酸序列。

6.根據權利要求2所述的方法，其中，ALA合酶是具有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的球形紅桿菌ALA合酶，NADP依賴的蘋果酸酶是具有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的大腸桿菌NADP依賴的蘋果酸酶，二羧酸轉運體是具有SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的大腸桿菌二羧酸轉運體，亞鐵螯合酶是具有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的大腸桿菌亞鐵螯合酶。

7.根據權利要求1所述的方法，進一步包括：使用琥珀酸將pH調節至7至9，以培養第一大腸桿菌生產宿主。

8.一種制備牛肌紅蛋白的方法，包括：

構建含有用于血紅素生物合成途徑酶的基因的第三質粒；

構建含有第三質粒的第二大腸桿菌生產宿主；

通過培養第二大腸桿菌生產宿主制備牛肌紅蛋白。

9.根據權利要求8所述的方法，其中血紅素生物合成途徑酶是ALA合酶、NADP依賴的蘋果酸酶、二羧酸轉運體和亞鐵螯合酶。

10.根據權利要求8所述的方法，其中，牛肌紅蛋白由具有SEQ ID NO:1所示氨基酸序列的珠蛋白和具有分子式1的血紅素組成，

11.根據權利要求8所述的方法，其中，第三質粒具有SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列。

12.根據權利要求8所述的方法，其中，ALA合酶是具有SEQ ID NO：2所示核苷酸序列的球形紅桿菌ALA合酶，NADP依賴的蘋果酸酶是具有SEQ ID NO:3所示核苷酸序列的大腸桿菌NADP依賴的蘋果酸酶，二羧酸轉運體是具有SEQ ID NO:4所示核苷酸序列的大腸桿菌二羧酸轉運體，亞鐵螯合酶是具有SEQ ID NO:5所示核苷酸序列的大腸桿菌亞鐵螯合酶。

13.根據權利要求8所述的方法，進一步包括：使用琥珀酸將pH調節至7至9，以培養第二大腸桿菌生產宿主。

14.一種制備牛肌紅蛋白的方法，包括：

構建含有用于牛肌紅蛋白MYG的基因的第二質粒；

構建含有第二質粒的第三大腸桿菌生產宿主；

通過培養第三大腸桿菌生產宿主生產珠蛋白；

通過微生物發酵或化學合成制備血紅素；

將珠蛋白與血紅素結合以得到牛肌紅蛋白。

15.根據權利要求14所述的方法，其中，第二質粒具有SEQ ID NO:8所示的核苷酸序列。