[發明專利]一種異源表達蔗糖異構酶的基因工程菌及應用

在審

• 申請號: 202111671721.1
• 申請日: 2021-12-31
• 公開（公告）號: CN114277049A
• 公開（公告）日: 2022-04-05
• 發明（設計）人: 王從綱;國丹;龐焦;孫佳明;李明玉;叢貴龍
• 申請（專利權）人: 李憲臻
• 主分類號: C12N15/75
• 分類號: C12N15/75;C12N15/61;C12N1/21;C12P19/12;C12P19/24;C12R1/125
• 代理公司: 大連東方專利代理有限責任公司 21212
• 代理人: 周媛媛;李馨

本發明公開了一種異源表達蔗糖異構酶的基因工程菌及應用，屬于工業生物技術領域。本發明構建了攜帶Pgrac100啟動子與13種不同信號肽和源自Klebsiella sp.LX3的蔗糖異構酶基因的重組枯草芽孢桿菌，通過比較確定含有WapA信號肽的重組菌的胞外酶活最高，搖瓶培養的胞外酶活達到23.03U/mL，進一步在5L發酵罐中進行發酵，將胞外酶活提高到124.97U/mL，純化的重組蔗糖異構酶具有優良的酶學性質。本發明為針對蔗糖異構酶高效異源表達及結構功能研究的基礎研究提供了一種有效策略，并且為實現蔗糖異構酶在工業上的規?；苽浜蛻玫於嘶A。

技術領域

本發明屬于工業生物技術領域，具體涉及一種能夠異源表達蔗糖異構酶的基因工程菌，以及該基因工程菌在異源表達蔗糖異構酶中的應用。

背景技術

異麥芽酮糖(α-D-吡喃葡糖基-1,6-D-果糖，Isomaltulose)是一種存在于蜂蜜、甘蔗汁中的還原性二糖，其作為蔗糖的同分異構體，具有與蔗糖類似的物理化學性質。異麥芽酮糖的甜度約為蔗糖的50％，然而，其具有保健功能，因此可以作為蔗糖的替代品，在無糖食品、無糖保健品、無糖藥品的生產中具有較大應用潛力。由于蜂蜜、甘蔗汁中的天然異麥芽酮糖含量較低，而且異麥芽酮糖難以用化學方法合成，因此目前國內外主要采用蔗糖異構酶催化蔗糖轉化法制備異麥芽酮糖。

蔗糖異構酶主要來源于細菌，已發現產蔗糖異構酶的細菌主要有：大黃歐文菌(Erwinia rhapontici)、紅色精朊桿菌(Protaminobacter rubrum)、普成沙雷氏桿菌(Serratia plymuthica)、多源發散菌(Pantoea dispersa)、克雷伯氏桿菌(Klebsiellasp.)等。目前已有很多報道利用野生菌發酵產蔗糖異構酶，如通過優化Klebsiella sp.LX3的培養條件，酶活達到15.12U/mL。Erwinia rhapontici NX-5野生菌發酵產酶的酶活為1.3U/mL。通過培養基優化，Erwinia sp.D12發酵產酶的酶活達到10.84U/mL。野生菌產蔗糖異構酶水平較低，不能滿足工業上規?；a和應用的需求，為了提高蔗糖異構酶的表達水平并且促進其在食品工業中的大規模應用，近年來開展了很多采用異源表達策略的研究工作，其中大部分工作采用大腸桿菌為宿主進行蔗糖異構酶的異源表達。來源于Erwiniarhapontici NX-5的蔗糖異構酶在大腸桿菌中利用乳糖為誘導劑在低溫下誘導表達，其酶活達到15U/mL，通過響應面法優化大腸桿菌的產酶發酵培養基，使得酶活達到29.1U/mL。同時，一些研究工作將蔗糖異構酶在食品安全級菌株中進行重組表達，源自Pantoeadispersa的蔗糖異構酶被成功展示于解脂耶氏酵母細胞表面，異麥芽酮糖轉化率達到93％。源自Enterobacter sp.FMB-1的蔗糖異構酶被成功展示于釀酒酵母細胞表面，在底物蔗糖濃度為50-250mM范圍內，轉化率為6.4-7.4％。利用Lactococcus lactis MG1363為宿主將源自Enterobacter sp.FMB-1的蔗糖異構酶進行了重組表達并且分泌到胞外，轉化率達到72％。源自Erwinia rhapontici NX-5的蔗糖異構酶基因在枯草芽孢桿菌WB800中實現了胞內表達，通過發酵罐放大和培養條件優化，使全細胞酶活達到5.2U/mL。由于現有異源表達蔗糖異構酶的基因工程菌的產酶量均有待提高，導致蔗糖異構酶的生產和使用成本，以及異麥芽酮糖的工業生產成本較高，嚴重制約了相關產業的發展，因此構建一種高水平表達重組蔗糖異構酶的基因工程菌，以促進蔗糖異構酶的工業化應用具有迫切的客觀需求。