[發(fā)明專利]一種DNA甲基轉移酶1的抗原肽及其多克隆抗體

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111661755.2
• 申請日: 2021-12-31
• 公開（公告）號: CN114350633A
• 公開（公告）日: 2022-04-15
• 發(fā)明（設計）人: 邱亞峰;馬志永;朱琳;魏建超;劉珂;李宗杰;李蓓蓓;邵東華
• 申請（專利權）人: 中國農(nóng)業(yè)科學院上海獸醫(yī)研究所（中國動物衛(wèi)生與流行病學中心上海分中心）
• 主分類號: C12N9/10
• 分類號: C12N9/10;C12N15/54;C07K16/40;G01N33/573
• 代理公司: 臺州浙粵壟專利代理事務所(普通合伙) 33419
• 代理人: 王洪臣

本發(fā)明具體涉及一種DNA甲基轉移酶1的抗原肽及其多克隆抗體，屬于分子克隆技術領域。本發(fā)明根據(jù)NCBI公布的預測的豬DNMT1序列，通過RT?PCR擴增得到了豬的DNMT1基因，利用真核表達系統(tǒng)構建了pFlag14?DNMT1(cloned)重組質粒，從豬DNMT1蛋白序列開始分析，構建能夠得到符合后續(xù)檢測要求的豬DNMT1蛋白合成肽多克隆抗體。本發(fā)明公開多克隆抗體檢測靈敏度高、特異性強，適用于人、豬、猴、牛、犬源DNMT1蛋白的快速檢測和相關研究。

技術領域

本發(fā)明屬于分子克隆技術領域，具體涉及一種DNA甲基轉移酶1的抗原肽及其多克隆抗體、制備方法及應用。

背景技術

DNA甲基轉移酶1(DNA methyltransferase 1，DNMT1)是哺乳動物基因組表觀遺傳修飾中DNA甲基化的關鍵基因，其編碼的蛋白是一種分子量大且功能復雜的酶，具有多種調控功能，參與機體發(fā)育過程中干細胞生長、細胞增殖、器官發(fā)育、衰老和腫瘤發(fā)生等多個生物學過程。一旦生物體內(nèi)Dnmt活性發(fā)生變化，將會引起基因組甲基化水平異常，使5'-CG-3'核苷酸島局部甲基化水平升高和基因組整體甲基化水平降低，從而導致基因組不穩(wěn)定，如染色體不穩(wěn)定、可移動遺傳因子激活、原癌基因表達和抑癌基因不表達等。因此分析Dnmt的活性對疾病的預防、治療和癌癥發(fā)生機制的研究有著十分重要的運用價值。

中國發(fā)明專利CN201210202062.1公開了O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶活性的檢測方法，即首次采用生物發(fā)光共振能量轉移技術和化學發(fā)光技術免疫檢測O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶活性：將鏈親和素-熒光素酶融合蛋白與生物素標記的O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶在0～40℃孵育30～60min，再加入熒光染料標記的O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶抗體，0～40℃孵育30～60min，然后再加入熒光素底物，4～30℃下靜置5～30min，檢測670nm處的發(fā)光強度，進而計算獲得O6-甲基鳥嘌呤-DNA甲基轉移酶活性。

中國發(fā)明專利CN201510595903.3公開了一種基于鏈置換放大和DNAzyme放大的檢測DNA甲基轉移酶活性的方法。設計一種三功能雙鏈DNA探針，利用DNA甲基轉移酶特異性地識別該三功能雙鏈DNA探針發(fā)生甲基化，HpaII限制性內(nèi)切酶特異性地切割殘余的未甲基化的雙鏈DNA，甲基化的雙鏈DNA引發(fā)鏈置換反應，釋放大量的8–17DNAzyme，8–17DNAzyme催化大量發(fā)夾型分子信標底物的切割，引發(fā)顯著的熒光增強。

上述檢測方法均使用了熒光染料的方式進行了DNA甲基轉移酶1的定量分析，但存在特異性較低，分析過程復雜的缺點，因此有必要開發(fā)一種能夠用來快速檢測的抗體，以便通過抗體進一步研究DNMT1的功能。有鑒于此，特提出本發(fā)明。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明根據(jù)NCBI公布的預測的豬DNMT1序列，通過RT-PCR擴增得到了豬的DNMT1基因，利用真核表達系統(tǒng)構建了pFlag14-DNMT1(cloned)重組質粒，從豬DNMT1蛋白序列開始分析，構建能夠得到符合后續(xù)檢測要求的豬DNMT1蛋白合成肽多克隆抗體，為DNMT1蛋白功能及作用機制的研究奠定重要的材料基礎，為DNMT1在家畜方面的研究提供了基礎資料。

為實現(xiàn)上述發(fā)明目的，本發(fā)明采用的技術方案如下:

本發(fā)明請求保護一種DNA甲基轉移酶1的抗原肽，所述DNA甲基轉移酶1的抗原肽的氨基酸序列如SEQ ID NO.l所示，其對應的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。該核苷酸序列根據(jù)GenBank中的豬DNMT1基因預測序列(XM_021082029.1)上進行選擇，豬DNMT1基因預測序列的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。

本發(fā)明還請求保護一種由所述DNA甲基轉移酶1的抗原肽免疫新西蘭大白兔制備得到的多克隆抗體。

本發(fā)明還請求保護一種抗DNMT1多克隆抗體的制備方法，包括如下步驟: