[發明專利]一種用于少刺、散磷草魚突變體鑒定的分子標記及方法

在審

• 申請號: 202111661607.0
• 申請日: 2021-12-31
• 公開（公告）號: CN114182043A
• 公開（公告）日: 2022-03-15
• 發明（設計）人: 鄭建波;賈永義;李飛;羅琛;顧志敏;劉士力;遲美麗;程順;劉一諾
• 申請（專利權）人: 浙江省淡水水產研究所
• 主分類號: C12Q1/6895
• 分類號: C12Q1/6895;C12Q1/6858;C12N15/11
• 代理公司: 杭州浙科專利事務所(普通合伙) 33213
• 代理人: 劉元慧

1.一種用于少刺、散磷草魚突變體鑒定的分子標記，其特征在于該分子標記的為E1M4S和E6M7S，各引物核苷酸序列如下：

上游引物E1M4S-F如SEQ.ID No1所示；

下游引物E1M4S-R如SEQ.ID No2所示；

上游引物E6M7S-F如SEQ.ID No3所示；

下游引物E6M7S-R如SEQ.ID No4所示。

2.一種利用權利要求1所述的用于少刺、散磷草魚突變體鑒定的分子標記的鑒別方法，其特征在于該鑒別方法包括以下步驟：1）首先提取草魚基因組DNA，并稀釋備用；2）建立酶切-連接反應；3）建立預擴增反應體系和預擴增反應程序；4）建立選擇性擴增體系和反應程序；5）聚丙烯酰胺凝膠電泳，銀染后獲得所需條帶。

3.如權利要求2所述的一種用于少刺、散磷草魚突變體鑒定的分子標記的鑒別方法，其特征在于步驟1）中，提取的是散磷草魚基因組DNA，稀釋成200ng/μL。

4.如權利要求2所述的一種用于少刺、散磷草魚突變體鑒定的分子標記的鑒別方法，其特征在于步驟2）中酶切-連接反應具體為：取200ng基因組DNA，用EcoR I和Mse I進行37℃雙酶切4 h后,75℃滅火15min，酶切片段與EcoR I和Mse I接頭連接，22℃過夜。

5.如權利要求2所述的一種用于少刺、散磷草魚突變體鑒定的分子標記的鑒別方法，其特征在于步驟3）中預擴增反應體系為：10×Buffer:溶液2μL, dNTP( 2.5 mM) 2μL, EcoRI預擴增引物(2.5 μM) 1μL, Mse I預擴增引物(2.5μM) 1μL, rTaq酶1.0 U, 連接產物3μL,用去離子滅菌水補足20μL；預擴增反應程序為: 94℃預變性5min, 接著94℃變性20s,56℃退火30 s, 72℃延伸2min，20個循環之后72℃延伸10 min。

6.如權利要求2所述的一種用于少刺、散磷草魚突變體鑒定的分子標記的鑒別方法，其特征在于步驟4）中選擇性擴增體系為：10×Buffer 溶液1.5μL, dNTP( 2.5mM) 1.2μL,EcoR I選擴引物(2.5 μM) 1μL, MseI選擴引物(2.5 μM) 1μL, rTaq酶2.0 U, 預擴產物1μL,用去離子滅菌水補足15μL；選擴反應程序為: 94℃預變性5 min, 接著94℃變性30s, 65℃（以后每循環降低1℃）退火30s, 72℃延伸1 min進行10個循環；然后94℃變性30s, 56℃退火30s，72℃延伸1min進行24個循環，72℃延伸7min。

7.如權利要求2所述的一種用于少刺、散磷草魚突變體鑒定的分子標記的鑒別方法，其特征在于步驟5）中，選擇性擴增產物加入等體積載樣緩沖液在非變性聚丙烯酰胺凝膠上進行250V恒電壓電泳，染色程序參考CARLOS JS的方法，漂洗之后進行拍照、記錄、分析。