[發(fā)明專利]一株生產(chǎn)普魯蘭多糖的出芽短梗霉的構(gòu)建及應(yīng)用

在審

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111649329.7
• 申請日: 2021-12-29
• 公開（公告）號: CN114381381A
• 公開（公告）日: 2022-04-22
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 張鑫;李海軍;唐雙焱;李珍愛;馬雙雙;王慶波;胡紅濤
• 申請（專利權(quán)）人: 山東福瑞達(dá)生物科技有限公司
• 主分類號: C12N1/15
• 分類號: C12N1/15;C12N15/54;C12N15/80;C12P19/10;C12P19/18;C12R1/645
• 代理公司: 濟南舜源專利事務(wù)所有限公司 37205
• 代理人: 劉寶

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一株生產(chǎn)普魯蘭多糖的出芽短梗霉的構(gòu)建及應(yīng)用。本發(fā)明在出芽短梗霉中過表達(dá)來自Aureobasidium melanogenum的UTG1基因，該基因編碼葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，選育得到的出芽短梗霉的普魯蘭多糖產(chǎn)量明顯提高，重組菌株比出發(fā)菌株產(chǎn)量可提升33.4％。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，尤其是一株生產(chǎn)普魯蘭多糖的出芽短梗霉的構(gòu)建及應(yīng)用。

背景技術(shù)

普魯蘭多糖是一種微生物胞外多糖。由于其具有諸多優(yōu)良特性如水溶性、生物降解性、生物兼容性、成膜性以及化學(xué)可塑性等，普魯蘭多糖及其衍生物可廣泛應(yīng)用于食品、醫(yī)藥、化妝品等領(lǐng)域。經(jīng)過多年的發(fā)展，雖然取得了較大進(jìn)展，但在普魯蘭多糖產(chǎn)量、底物轉(zhuǎn)化率、發(fā)酵周期以及分子量控制等方面還存在諸多問題。

目前文獻(xiàn)當(dāng)中關(guān)于普魯蘭多糖產(chǎn)量提高主要是通過尋找高產(chǎn)菌株、誘變篩選等為主，往往效果不太明顯，發(fā)酵周期長，底物轉(zhuǎn)化率不高，且整個發(fā)酵培養(yǎng)基都需要高溫，導(dǎo)致普魯蘭多糖成本居高不下。如何經(jīng)濟高效節(jié)能的采用出芽短梗霉發(fā)酵生產(chǎn)普魯蘭多糖，成為本領(lǐng)域的研究熱點。

因此，開發(fā)普魯蘭多糖生產(chǎn)工藝，對于提高普魯蘭多糖的產(chǎn)量、降低生產(chǎn)成本、拓寬普魯蘭多糖應(yīng)用領(lǐng)域、提高產(chǎn)品附加值具有重要的現(xiàn)實意義。

發(fā)明內(nèi)容

針對現(xiàn)有技術(shù)的上述不足，本發(fā)明提供一株生產(chǎn)普魯蘭多糖的出芽短梗霉的構(gòu)建及應(yīng)用，在出芽短梗霉中過表達(dá)來自Aureobas idium melanogenum的UTG1 基因，該基因編碼葡萄糖基轉(zhuǎn)移酶，選育得到的出芽短梗霉的普魯蘭多糖產(chǎn)量明顯提高。

一方面，本發(fā)明提供一株出芽短梗霉的構(gòu)建方法：包括以下步驟：

(1)提取Aureobasidium melanogenum的RNA，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA，并以此為模板，進(jìn)行UTG1基因的擴增；

(2)得到整個UTG1的編碼區(qū)，與PMD18-T連接，轉(zhuǎn)化E.coli JM109感受態(tài)細(xì)胞，篩選獲得陽性重組子，測序正確后，經(jīng)擴大培養(yǎng)后取菌液提取質(zhì)粒用SSeⅠ和salⅠ酶酶切，載體SPAX13-NS也用相同的酶酶切后，用T4 DNA連接酶進(jìn)行連接；轉(zhuǎn)到大腸桿菌中用氨芐青霉素平板進(jìn)行篩選，挑取陽性轉(zhuǎn)化子進(jìn)行擴繁，提取質(zhì)粒SPAX13-NS-UTG1；

(3)用EcoRⅠ和SmaⅠ對SPAX13-NS-UTG1質(zhì)粒進(jìn)行酶切，得到的線性化片段電轉(zhuǎn)到感受態(tài)出芽短梗霉中得到重組出芽短梗霉。

本方案進(jìn)一步改進(jìn)，步驟(1)中的擴增條件為：94℃、5min，94℃、10s，58℃、30s，72℃、2.5min，進(jìn)行30個循環(huán)，延伸處理時條件為72℃、15min， 4℃存放。

本方案進(jìn)一步改進(jìn)，步驟(1)中UTG1基因擴增時引物序列為：

UTG-F:ACTAGTATGGTGCGATACCAGCACCTGGCAG；

UTG-R:GTCGACCTACAACTCATCATGCTTCTTCTGC。

其中，感受態(tài)出芽短梗霉制備方法如下：

出芽短梗霉甘油管取100μL菌種接種到50mLYPD液體培養(yǎng)基中，在28℃溫度下以240r/min培養(yǎng)15h直至OD600＝1.0，冰浴30min；

在8000r/min條件下離心1min，舍棄上清液；

利用25mL山梨醇-檸檬酸三鈉溶液重懸菌體，在8000r/min的轉(zhuǎn)速下離心1 min，棄掉上清液，再重復(fù)一次；

用4mL山梨醇-梓檬酸三鈉重懸菌體，加入50mg/mL濃度的Lyzing Enzyme，使酶的終濃度為0.125mg/mL；