[發明專利]一種腸道樣本的保存液和腸道樣本的保存方法

在審

• 申請號: 202111644580.4
• 申請日: 2021-12-29
• 公開（公告）號: CN114431223A
• 公開（公告）日: 2022-05-06
• 發明（設計）人: 丁佳女;鄭宜文;葉俊波
• 申請（專利權）人: 杭州百邁生物股份有限公司
• 主分類號: A01N1/02
• 分類號: A01N1/02
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本發明提供了一種用于保存腸道樣本中微生物核酸完整性的保存液及保存方法。保存液包括Tris?HCl、乙酸、乙酸鈉、Triton X?100、鹽酸胍、脲、乙二胺四乙酸二鈉、乙醇、青霉素、硫酸鏈霉素和蛋白酶K。將上述保存液和腸道樣本混合均勻后可在常溫條件下長期保存。本發明所述保存液和保存方法可以抑制微生物生長繁殖并破壞微生物結構釋放其核酸，且含有抑制核酸酶活性成分，避免釋放的核酸降解，同時提供了長期穩定保存核酸穩定性的緩沖體系，保存時間長，適用溫度范圍廣。

技術領域

本發明涉及生物技術領域，更為具體的是涉及用于保存腸道樣本中微生物核酸完整性的保存液。

背景技術

腸道菌群，作為寄居在人體腸道內微生物的總稱，作為人類的第二套基因組，越來越受到研究者及社會的關注。人類腸道中約有10¹⁴個，超過1000種細菌，其基因組總量約是人體基因組的100倍。腸道菌群這個復雜的微生態系統，對宿主的健康有著重要意義，腸道菌群失調會導致一系列的健康問題，包括腸道疾病(如腸易激綜合癥、腹瀉、脹氣、便秘、消化不良等)、代謝綜合癥(如肥胖、糖尿病、高血壓等)、免疫力低下，營養消化吸收不良等。

腸道樣本，可反映該人體腸道菌群狀況。目前采用16S rDNA法鑒定腸道樣本中所有細菌種類，通過生物信息分析腸道菌群的種類，然后依靠大量參考文獻和實驗室對照數據，獲知該人體腸道菌群的比例是否正常，從而判斷是否患某種疾病，進而給出相應的膳食建議。

16S rDNA鑒定是指利用細菌16S rDNA序列測序的方法對細菌進行種屬鑒定，是目前較為常見和通用的細菌種屬鑒定方法。16S rDNA基因的序列有10 個保守區和9個高變區(V1-V9:長度分布范圍約30～100bp)之分。保守區為所有細菌共有，細菌間無差別，能反映生物物種的親緣關系，可變區具有屬或種的特異性，序列則隨菌間的親緣關系不同而有一定的差異，所以能揭示生物物種的特征核酸序列，被認為是最適于細菌系統發育和分類鑒定的指標。根據保守區設計引物位點，擴增可變區獲得的序列可以用于菌種鑒定。因此想要如實的反映人體腸道的菌群狀況，就需要保持腸道樣本菌群核酸的穩定性。

由于腸道樣本離體后，其環境發生變化，其中提供微生物代謝的能量來源也只消耗不補充狀態，與此同時，其中部分細菌還保持了活性，繼續代謝和生長，而由于環境變化，不同細菌其增長與死亡的速率已經不同于排便前。因此，需要對腸道樣本進行一些保護措施，盡量將其中微生物的構成穩定在剛剛離體時的狀態，從而最好的代表受試者腸道中的共生微生物。目前采用的保存方法有采集后立即冷凍保存或用特定保存液搖勻室溫保存。

為鑒定腸道樣本中腸道菌群的準確性，使腸道菌群內的微生物種類保持與在體內時菌群分布保持一致性，要求腸道樣本從受試者到實驗室途中不受地域、時間、溫度影響，有必要研究確定合適的保存液，使得在常溫下就能保存且不改變微生物構造。因此需要考慮以下兩點，一是要確保腸道樣本排出體外后能迅速無菌保藏。二是病人地域分布廣，要確保在運輸途中，樣品不受時間和溫度影響。所以，確定一種保存液用來存儲腸道樣本就顯得十分重要。病人只需要將采集的腸道樣本置于保存液中搖勻，無需凍存，即可達到穩定其中微生物構造的作用，能夠用于腸道樣本的長途運輸，也方便實驗人員的鑒定工作。

發明內容

本發明的目的是提供一種保存腸道樣本中微生物核酸完整性的保存液和保存方法、以及保存液的制備方法。本發明所述保存液，可在常溫條件下長期保存腸道樣本，方便采樣者在任何時候可以進行采樣及樣本保存，同時滿足樣本長途運輸的要求。其中的保存液無毒性試劑，使用簡單，可在常溫條件下保存腸道樣本，保存時間長達1年；保存的腸道樣本常溫條件下即可進行轉運。

為實現上述發明目的，本發明采取的技術方案包括：提供一種用于保存腸道樣本中微生物核酸完整性的保存液，包括緩沖劑、抗生素、有機醇和變性劑，所述抗生素為至少兩種抗生素，所述有機醇為高濃度有機醇。進一步的，所述保存液還包括去污劑、金屬離子螯合劑、有機酸和蛋白酶K。

進一步的，所述變性劑包括鹽酸胍和脲。