[發明專利]一種雙歧桿菌的制備方法及其在腫瘤治療中的應用

在審

• 申請號: 202111609579.8
• 申請日: 2021-12-27
• 公開（公告）號: CN114657086A
• 公開（公告）日: 2022-06-24
• 發明（設計）人: 穆延召;蔡軍;孫欽利;徐小釩
• 申請（專利權）人: 蘇州善佰生物技術有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C12N1/02;A61K9/48;A61K35/745;A61P35/00;C12R1/01
• 代理公司: 合肥律通專利代理事務所(普通合伙) 34140
• 代理人: 吳奇

本發明涉及一種雙歧桿菌的制備方法，收集臨床接受PD?1抗體藥物治療的患者不同治療周期的糞便樣本；提取糞便樣本的微生物DNA；擴增16S rDNA V3?V4區序列，將擴增產物測序；根據患者接受PD?1治療后療效的不同；取療效較好一組患者的糞便，用0.9％生理鹽水按體積比1:100進行稀釋；稀釋后用涂布棒涂抹在雙歧桿菌選擇性培養基上，37℃厭氧培養；挑選單菌斑，接種在雙歧桿菌選擇性液體培養基中，37℃厭氧培養24h；離心濃縮菌體，檢測確認分離的細菌是雙歧桿菌；繼續擴大培養即得雙歧桿菌。本發明雙歧桿菌制備方法簡單，用于治療腫瘤是一種新的應用方向，也是一種新的治療腫瘤的方法，且無毒副作用。

技術領域

本發明涉及生物工程技術領域，尤其涉及一種雙歧桿菌的制備方法及其在腫瘤治療中的應用。

背景技術

2018年6月15日，NMPA批準了國內首個免疫檢查點抑制劑單抗藥物：BMS的Opdivo(O藥)，用于非小細胞肺癌的二線治療。截止2019年底，國內已經有BMS、MSD、上海君實、蘇州信達、江蘇恒瑞的5個PD1藥物獲NMPA批準，適應癥包括：非小細胞肺癌、肝癌、黑色素瘤等。與此同時，不僅5家已經獲批的免疫檢查點抑制劑在擴大適應癥，還有大量新的免疫檢查點抑制劑在臨床和注冊審批階段。腫瘤治療正逐步進入免疫治療階段。

但是，目前免疫檢查點抑制劑的有效率偏低，整體只有20％左右，而且在不同患者間存在巨大的差異，進一步研究發現：腫瘤PD1等免疫治療的療效與腸道菌群組成密切相關。Routy等分析了249名患肺癌、腎癌等腫瘤并接受抗PD-1免疫抑制劑治療的患者，69名同時接受廣譜抗生素治療(ATB),結果發現接受ATB治療的患者平均總生存期為8.3個月，遠遠低于非ATB患者的15.3個月。York等人在黑色素瘤患者中發現，接受抗PD1治療有效的黑色素瘤患者的口腔及腸道菌群，多樣性、豐度及組成與無效者相比呈顯著差異。2017年，Gajewski等人發現長雙歧桿菌與黑色素瘤患者對PD1抑制劑的響應相關，Wargo等人則鑒定出疣微菌科與黑色素瘤患者對PD1抑制劑的響應相關。而雙歧桿菌在腫瘤治療中的應用及運用方法尚未見相關研究成果。

發明內容

本發明的目的是提供一種雙歧桿菌的制備方法及其在腫瘤治療中的應用。

一種雙歧桿菌的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

(1)收集臨床接受PD-1抗體藥物治療的患者不同治療周期的糞便樣本；

(2)提取糞便樣本的微生物DNA；

(3)擴增16S rDNAV3-V4區序列，將擴增產物測序；

(4)根據患者接受PD-1治療后療效的不同，將患者分為兩組，療效較好的一組，療效不好的一組，分析兩組患者糞便中微生物組成結構的差異；

(5)取療效較好一組患者的糞便，用0.9％生理鹽水按體積比1:100進行稀釋；

(6)稀釋后用涂布棒涂抹在雙歧桿菌選擇性培養基上，37℃厭氧培養；

(7)挑選單菌斑，接種在雙歧桿菌選擇性液體培養基中，37℃厭氧培養24h；

(8)離心濃縮菌體，檢測確認分離的細菌是雙歧桿菌；

(9)繼續擴大培養即得雙歧桿菌。

作為優選，所述檢測確認的方法為，提取離心濃縮菌體的DNA，擴增16s全長片段，進行一代測序，測序結果顯示分離的細菌是雙歧桿菌即可。

一種利用雙歧桿菌制備膠囊藥物的方法，其特征在于，步驟為：

(1)擴大培養到對數期后，離心，獲得雙歧桿菌沉淀；

(2)用0.9％的生理鹽水重懸雙歧桿菌，10g雙歧桿菌加入1000ml生理鹽水；