[發明專利]一種木本植物根內叢枝菌根真菌的高效染色方法及其應用

在審

• 申請號: 202111595475.6
• 申請日: 2021-12-23
• 公開（公告）號: CN114459860A
• 公開（公告）日: 2022-05-10
• 發明（設計）人: 姚青;尹喜龍;朱紅惠;張微
• 申請（專利權）人: 華南農業大學
• 主分類號: G01N1/30
• 分類號: G01N1/30
• 代理公司: 廣州市時代知識產權代理事務所(普通合伙) 44438
• 代理人: 梁美玲

1.一種木本植物根內叢枝菌根真菌的高效染色方法，其特征是：將待染色木本植物根內叢枝菌根進行組織切片，使得切片厚度為60μm～100μm，將所得的切片進行染色處理。

2.根據權利要求1所述的一種木本植物根內叢枝菌根真菌的高效染色方法，其特征是：最佳切片厚度為80μm。

3.根據權利要求1所述的木本植物根內叢枝菌根真菌的高效染色方法，其特征是：所述組織切片的步驟包括選取長度為0.5cm～2cm左右的受叢枝菌根真菌侵染的木本植物根段，用低熔點瓊脂糖將其包埋并固定在載玻片上，使用振動切片機Leica VT1000 S進行切片，切片程序為：切片速度0.165mm/s～0.175mm/s，切片頻率為40Hz～60Hz。

4.根據權利要求1所述的木本植物根內叢枝菌根真菌的高效染色方法，其特征是：所述染色處理的方法為臺盼藍染色法，所述臺盼藍染色法包括以下步驟：

a)消化：將切片加入6％～10％(W/V)KOH，以80℃～90℃水浴50min～60min，除去細胞中的細胞質；

b)酸化：將切片取出沖洗干凈后，加入0.15M～0.2M HCl，室溫放置4min～5min；

c)染色：加入0.03％～0.05％(W/V)臺盼藍染液染色，室溫染色6min～10min；

d)脫色：置于脫色液中脫色1d～2d，使非叢枝菌根真菌結構脫色；

e)觀察和拍照記錄。

5.根據權利要求4所述的木本植物根內叢枝菌根真菌的高效染色方法，其特征是：所述步驟d)中，所述脫色液由乳酸、甘油和蒸餾水混合獲得，其中乳酸、甘油和蒸餾水的體積之比為(1～2)：(1～2)：(1～2)。

6.根據權利要求1所述的木本植物根內叢枝菌根真菌的高效染色方法，其特征是：所述染色處理的方法為雙重熒光染色，所述雙重熒光染色法包括以下步驟：

a)漂白：將切片置于40％～50％(W/V)的乙醇中孵育1h～3h，漂白根系；

b)透明：加入15％～20％(W/V)KOH溶液孵育1d～2d，使根系透明；

c)染色：將切片取出并使用pH 7～7.4的PBS緩沖液沖洗干凈后，加入0.15ug/ml～0.2ug/ml AlexaWGA 488熒光染料，室溫孵育10h～15h，隨后加入0.1ug/ml～2ug/mlSigma-Nile Red熒光染料，抽真空孵育20min～30min；

d)清洗：用pH 7～7.4的PBS緩沖液震動清洗3次以上，以洗去浮色；

e)觀察和拍照記錄。

7.一種木本植物根內叢枝菌根真菌的高效染色方法的應用，其特征是：采用權利要求1-6任一項所述的木本植物根內叢枝菌根真菌的高效染色方法，將其應用在觀察木本植物根內叢枝菌根生長狀態或測定木本植物根內叢枝菌根侵染率中。