[發(fā)明專利]一種基于CRISPR/Cas13a系統(tǒng)的SERS檢測試劑盒、其制備方法與應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111590131.6
• 申請日: 2021-12-23
• 公開（公告）號: CN114317686B
• 公開（公告）日: 2023-08-11
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 宋春元;汪聯(lián)輝;張晶晶
• 申請（專利權(quán)）人: 南京郵電大學(xué)
• 主分類號: C12Q1/6837
• 分類號: C12Q1/6837;C12Q1/682;C12Q1/6886;C12N15/11
• 代理公司: 南京經(jīng)緯專利商標(biāo)代理有限公司 32200
• 代理人: 曹翠珍

1.一種基于CRISPR/Cas13a系統(tǒng)的SERS檢測試劑盒，其特征在于，包括CRISPR/Cas13a系統(tǒng)、枝狀雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系和SERS檢測芯片三部分；

所述CRISPR/Cas13a系統(tǒng)包括Cas13a蛋白、crRNA和尿嘧啶修飾的發(fā)夾型識別單鏈RP；

所述枝狀雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系包括修飾有染料分子ROX的發(fā)夾型DNA單鏈H1，發(fā)夾型DNA單鏈H2和H3；

所述SERS檢測芯片為表面修飾有捕獲單鏈C的銀納米棒陣列基片；

所述crRNA堿基序列如SEQ?ID?NO：2所示：

crRNA：5’-?GAC?CAC?CCC?AAA?AAU?GAA?GGG?GAC?UAA?AAC?CUA?CCU?GCA?CUG?UAA?GCACUU?UU?-3’；

所述尿嘧啶修飾的發(fā)夾型識別單鏈RP的堿基序列如SEQ?ID?NO：3所示：

RP：5’-ACT?ACC?ATG?ATC?/rU//rU//rU/?/rU//rU//rU/?GTT?AGA?TCT?CCA?GTT?ATCATG?GTA?GTT?GGA?-3’；

所述發(fā)夾型DNA單鏈H1的堿基序列如SEQ?ID?NO：4所示：

H1：5’-?ROX-?TCC?AGT?TAT?CAT?GTT?AAG?CGA?TGA?TAA?CTG?GAG?ATC?TAA?C?-3’；

所述發(fā)夾型DNA單鏈H2的堿基序列如SEQ?ID?NO：5所示：

H2：5’-?CGC?TTA?ACA?TGA?TAA?CTG?GAG?TTA?GAT?CTC?CAG?TTA?TCA?TTG?CGG?TGACAC?GGC?AGT?TAG?A?-3’；

所述發(fā)夾型DNA單鏈H3的堿基序列如SEQ?ID?NO：6所示：

H3：5’-?TCT?AAC?TGC?CGT?GTC?ACC?GCA?GTT?AGA?TCT?CCA?GTT?ATC?AT?-3’；

所述捕獲單鏈C的堿基序列如SEQ?ID?NO：7所示：

C：5’-?SH-(CH₂)₆?-TTT?TTT?TTT?TTC?CAA?CTA?CC?-3’。

2.權(quán)利要求1所述的一種基于CRISPR/Cas13a系統(tǒng)的SERS檢測試劑盒的制備方法，其特征在于，包括以下步驟：

（一）CRISPR/Cas13a系統(tǒng)的制備：包括Cas13a蛋白、crRNA和尿嘧啶修飾的發(fā)夾型識別單鏈RP的制備；

所述Cas13a蛋白與crRNA的濃度為0.1~1?μM，所述尿嘧啶修飾的發(fā)夾型識別單鏈RP的濃度為1~10?μM；

（二）枝狀雜交鏈?zhǔn)椒磻?yīng)體系的制備：包括修飾有染料分子ROX的發(fā)夾型DNA單鏈H1，發(fā)夾型DNA單鏈H2和H3的制備；

所述的發(fā)夾型DNA單鏈H1、H2和H3的濃度為5~20?μM；

（三）SERS檢測芯片制備：

（1）制備銀納米棒陣列并用DEPC處理水多次沖洗；

（2）將銀納米棒陣列和20?μL?0.5~2?μM?捕獲單鏈C溶液共培養(yǎng)，捕獲單鏈C通過巰基與銀形成共價鍵而固定在銀納米棒陣列表面；

培養(yǎng)條件：25~37℃，60~80%濕度環(huán)境中靜置3~5小時；

（3）使用反應(yīng)緩沖液清洗基片后，將20?μL?1~100?μM?6-巰基己醇滴加至上述基片表面置于37℃恒溫混勻儀中反應(yīng)20分鐘；

（4）依次用反應(yīng)緩沖液和DEPC處理水多次清洗基片，得到SERS檢測芯片。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的一種基于CRISPR/Cas13a系統(tǒng)的SERS檢測試劑盒的制備方法，其特征在于：反應(yīng)緩沖液是10?mM?Tris-HCl，50?mM?KCl，1.5?mM?MgCl₂，pH?8.3。

4.權(quán)利要求1所述的一種基于CRISPR/Cas13a系統(tǒng)的SERS檢測試劑盒用于檢測血清中微小核酸microRNA的應(yīng)用，所述的應(yīng)用是非疾病診斷目的的。