[發明專利]一種新型的非核糖體多肽合成酶拆分表達方法

在審

• 申請號: 202111589828.1
• 申請日: 2021-12-23
• 公開（公告）號: CN114657155A
• 公開（公告）日: 2022-06-24
• 發明（設計）人: 徐玉泉;岳群;尹淼淼;張禮文
• 申請（專利權）人: 中國農業科學院生物技術研究所
• 主分類號: C12N9/00
• 分類號: C12N9/00;C12N15/52;C12N15/81;C12N1/19;C12R1/865
• 代理公司: 北京知文通達知識產權代理事務所(普通合伙) 16051
• 代理人: 劉江良

1.一種NRPS拆分單元，其序列為T_n-1-C_n-A_n-T_n；其中，若為起始模塊，則從起始密碼子至T1為起始拆分單元；若為最后一個模塊，則從前一個模塊的T至終止密碼子為終止拆分單元；若模塊中含有甲基化結構域、雜環化結構域、異構化結構域等修飾結構域，則拆分單元中也添加相應修飾結構域；且拆分單元中結構域組成與相應模塊中結構域組成一一對應；

其中T為硫酯化結構域、A為腺苷化結構域、C為縮合結構域，n為NRPS中模塊的序號。

2.如權利要求1所述的NRPS拆分單元，其特征在于，其拆分的原始序列如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

3.如權利要求1的所述NRPS拆分單元，其特征在于，T_n-1-C_n-A_n-T_n的N端起始于A_n-1sub與T_n-1之間的linker區，C端終止于C _n+1的1~10氨基酸。

4.如權利要求1的所述NRPS拆分單元，其特征在于，所述NRPS含有兩個或多個模塊。

5.編碼如權利要求1至4任一項所述的NRPS拆分單元的編碼核苷酸序列，優選地，其原始核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。

6.含有如權利要求5所述的編碼核苷酸序列的重組菌，優選為真菌為酵母、絲狀真菌，優選為釀酒酵母。

7.一種非核糖體多肽合成酶拆分表達方法，其特征在于，通過雙T式NRPS拆分表達方式將一個NRPS基因的表達轉換為以拆分單元為獨立基因的多基因的共表達，以高效獲得相應的非核糖體多肽產物，其中所述NRPS拆分單元具有下述序列：T_n-1-C_n-A_n-T_n；其中，若為起始模塊，則從起始密碼子至T₁為起始拆分單元；若為最后一個模塊，則從前一個模塊的T至終止密碼子為終止拆分單元；若模塊中含有甲基化結構域、雜環化結構域、異構化結構域，則拆分單元中也添加相應修飾結構域；且拆分單元中結構域組成與相應模塊中結構域組成一一對應；

其中T為硫酯化結構域、A為腺苷化結構域、C為縮合結構域，n為NRPS中模塊的序號。

8.如權利要求7所述的拆分表達方法，其特征在于，其拆分的原始序列如SEQ ID NO.1所示的氨基酸序列。

9.如權利要求7所述的拆分表達方法，其特征在于，所述拆分表達適合于NRPS在真菌中的異源表達，優選地所述真菌為酵母、絲狀真菌，優選為釀酒酵母。

10.如權利要求7所述的拆分表達方法，其特征在于，

1) 根據目標NRPS的基因序列與拆分位點設計引物，并在引物末端添加相應的起始密碼子、終止密碼子以及載體同源片段；通過PCR對拆分單元進行擴增，進一步通過無縫克隆進行連接與克隆，獲得拆分單元的表達載體；

2）通過轉化將獲得的表達載體轉入宿主細胞中；

3）發酵檢測陽性轉化子，用于表達所述的非核糖體多肽。