[發明專利]一種陳氏刺棘蟲的檢測試劑盒及其應用

有效

• 申請號: 202111589190.1
• 申請日: 2021-12-23
• 公開（公告）號: CN114277158B
• 公開（公告）日: 2022-07-19
• 發明（設計）人: 宋銳;高金偉;吳浩;袁希平;王志明;謝敏;程小飛;伍遠安;歐東升
• 申請（專利權）人: 湖南省水產科學研究所
• 主分類號: C12Q1/6888
• 分類號: C12Q1/6888;C12Q1/686;C12N15/11
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所(普通合伙) 42001
• 代理人: 余曉雪

本發明公開了一種快速檢測環境和魚體中陳氏刺棘蟲的檢測試劑盒及檢測方法，屬于寄生蟲病原體檢測技術領域。本發明還公開了檢測陳氏刺棘蟲的實時熒光定量PCR引物，可快速檢測養殖水體和魚體中的陳氏刺棘蟲的幼蟲和成蟲，大大提高了檢測效率，節約了檢測時間及檢測成本。本發明特異性強，對養殖水體環境DNA沒有非特異性擴增，靈敏度高，高達10copies/μL。

技術領域

本發明涉及魚類寄生蟲病原體的檢測領域，涉及一種魚類致病菌檢測試劑盒，尤其涉及一種陳氏刺棘蟲的檢測試劑盒及其應用。

背景技術

刺棘蟲屬(Acanthosentis)是棘頭動物門、始新棘頭蟲綱、圓棘頭蟲目、四環科的一屬，主要寄生于魚類，可給水產養殖業帶來重大經濟損失。刺棘蟲可感染多種魚類，包括鰻鱺、瓦氏黃顙魚、南方馬口魚、鱸、紅鰭鲌、鰶、刀鱭、鰱、鳙、鯽等。在我國目前報道較多的刺棘蟲為陳氏刺棘蟲(Acanthosentis cheni)，其生活史中陳氏刺棘蟲需要利用節肢動物作為中間宿主，如水環境中的蚤類等都可能成為其中間宿主。寄生蟲的成蟲主要寄生在魚類的幽門盲囊，幼魚感染可引起大面積死亡，成魚感染可引起其腸道微生物結構發生變化，造成特定微生物物種組成的變化，引起魚類免疫力下降，降低其抵御病原菌感染的能力，給水產養殖帶來危害。

目前我國檢查陳氏刺棘蟲主要通過顯微鏡鏡檢蟲體及蟲卵形態學，這些方法都存在對檢測樣本要求嚴格(必須獲得成熟雄蟲并對其粘液腺進行觀察)、敏感性低、假陽性等問題，利用顯微鏡檢查水環境樣本中的刺棘蟲幼蟲更是費時費力且準確性極低。

為了及時控制養殖魚類魚病發生，迫切需要一種能快速檢測魚體內或養殖水體中是否存在寄生蟲的技術，因此提供一種同時檢測三種刺棘蟲的多重實時熒光定量PCR引物和探針及配套試劑盒是本領域技術人員亟需解決的問題。

發明內容

發明目的：本發明所要解決的技術問題是提供了引物組合、引物對、檢測陳氏刺棘蟲的試劑盒，該引物對的靈敏度可達10copies/μL，該檢測試劑盒是以待檢樣品中陳氏刺棘蟲COX2基因為檢測對象，準確度及精密度均較好。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：引物組合，所述引物組合具有：

(I)上游引物具有如SEQ ID NO：1或SEQ ID NO：3或SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：9所示的核苷酸序列；和

(II)、下游引物具有如SEQ ID NO：2或SEQ ID NO：4或SEQ ID NO：6或SEQ ID NO：8或SEQ ID NO：10所示的核苷酸序列；或

(III)、如(I)和/或(II)所示的核苷酸序列經取代、缺失或添加一個或多個堿基獲得的核苷酸序列，且與(I)和/或(II)所示的核苷酸序列功能相同或相似的核苷酸序列；或

(IV)、與(I)和/或(II)所示的核苷酸序列至少有80％同源性的核苷酸序列。

本發明內容還包括引物對，所述引物對包括上游引物ACCOX2-I-F和下游引物ACCOX2-I-R；所述上游引物ACCOX2-I-F如序列SEQ ID NO：5所示；所述下游引物ACCOX2-I-R如序列SEQ ID NO：6所示。

本發明內容還包括所述的引物組合或所述的引物對在制備檢測陳氏刺棘蟲的試劑或試劑盒中的應用。

其中，所述應用中檢測的樣品為魚樣組織。

本發明內容還包括一種陳氏刺棘蟲的檢測試劑盒，所述陳氏刺棘蟲的檢測試劑盒包括所述的引物組合或所述的引物對。

作為優選，所述上游引物和下游引物的濃度比是3:4。

作為優選，所述陳氏刺棘蟲的檢測試劑盒還包括陽性對照和陰性對照。