[發明專利]一種菌種保藏保護劑及其制備方法和應用

在審

• 申請號: 202111576098.1
• 申請日: 2021-12-22
• 公開（公告）號: CN114214198A
• 公開（公告）日: 2022-03-22
• 發明（設計）人: 楊明;李秋園;吳超勇;代淑梅
• 申請（專利權）人: 中溶科技股份有限公司
• 主分類號: C12N1/04
• 分類號: C12N1/04
• 代理公司: 唐山科軒專利代理事務所(特殊普通合伙) 13146
• 代理人: 王永紅

本發明屬于生物發酵技術領域，特別是涉及一種保存菌種保護劑及其制備方法和應用。所述菌種保藏保護劑由以下質量分數的成分組成：10~20%甘油、2~5%海藻糖、0.04~0.1%胰蛋白胨、0.05~0.8%卵磷脂、0.01~0.05%硫代乙醇酸鈉、0.01~0.03%亞硫酸氫鈉、余量為去離子水。本發明提供的菌種保護劑能能解決傳統甘油保護劑中菌體的不均勻狀態，同時確保菌體性狀的穩定，防止外界環境對菌體的毒害，同時該保藏方法成本低，無需購買專用設備，并且菌種存活率高，傳代性能穩定。

技術領域

本發明屬于生物發酵技術領域，特別是涉及一種保存菌種保護劑及其制備方法和應用。

背景技術

優良的菌種是生物發酵生產的核心，是提供高效高產的保證。菌種保藏是指保持微生物菌株的生活力和遺傳性狀的技術。菌種保藏有多種方法，其原理大多大同小異，主要是運用一些方式盡量降低生物體內的代謝，達到延長生命，減少變異的目的。通常采用的方法為低溫、缺氧、干燥。低溫、干燥和隔絕空氣是使微生物代謝能力降低的重要因素，所以，菌種保藏方法雖多，但都是根據這三個因素而設計的。

目前工業上常用的菌種保藏方法包括：斜面低溫保藏法、液體石蠟保藏法、半固體穿刺保藏法、沙土管保藏法、冷凍真空干燥法、液氮超低溫凍存法等。這些菌種保藏方法各有其優缺點。例如斜面低溫保藏法雖然操作簡便，成本低廉，復蘇方便，但其保藏時間較短，而且因連續傳代而容易引入基因突變或者雜菌，培養基的理化性質及微生物代謝產物等原因還會導致微生物性狀發生改變；液體石蠟保藏法由于要試管直立保存，因此比較耗費空間，不便于攜帶；沙土管保藏法對于營養細胞效果不好；冷凍真空干燥法和液氮超低溫凍存法對設備和操作人員要求高，操作繁瑣。

為了克服上述缺陷，很多研究者對菌種保藏保護劑進行了研究，以期達到高效、簡便的、穩定性好的菌種保藏目的，如專利CN 106544275 A和CN 111454843 A均提供了一種菌種保護劑的解決方案。但不同的菌種保護劑對菌種的保護性能差異較大，而且目前報道的菌種保護劑均從細胞學角度對菌種的穩定性的考慮，未考慮到在保藏過程中外界因素對細胞毒性的侵害。

發明內容

本發明的目的在于克服上述菌種保藏方法的缺陷，提供一種操作簡便、生物安全性高、保藏效能穩定、成本低廉的菌種保護劑及保藏方法。

為實現上述目的，本發明提供如下技術方案：一種菌種保藏保護劑包含以下成分及質量含量：10~20%甘油，2~5%海藻糖，0.04~0.1%胰蛋白胨；0.05~0.8%卵磷脂，0.01~0.05%硫代乙醇酸鈉，0.01~0.03%亞硫酸氫鈉，余量為去離子水。

作為優選，所述菌種保護劑包含以下成分及質量含量：15%甘油，3.5%海藻糖，0.07%胰蛋白胨；0.65%卵磷脂，0.03%硫代乙醇酸鈉，0.02%亞硫酸氫鈉，余量為去離子水。

以上菌種保護劑的制作方法為：按照菌種保護劑中各成分的質量配比，將甘油、海藻糖、胰蛋白胨、卵磷脂、硫代乙醇酸鈉、亞硫酸氫鈉與去離子水充分混合，于55-65℃水浴中將其完全溶解，將溶解后的菌種保護劑于120~125℃濕熱滅菌18-25min備用。

優選地，所述水浴的溫度為60℃。

優選地，所述濕熱滅菌的溫度為122℃。

優選地，所述濕熱滅菌的溫度為20min。

一種上述菌種保護劑的應用，采用以下方法：將所述菌種保護劑與菌種混合，菌種保護劑與菌種混合后菌種的濃度為10³~10⁷cfu/mL，于≤-20℃保藏。

上述菌種保護劑中各成分協同作用，實現對菌種的長期保藏。其中甘油是常規保護劑，可降低冰點，避免菌體損傷；海藻糖能保護蛋白質分子不變性失活，保持細胞的生命體征；胰蛋白胨提供氮源；卵磷脂、硫代乙醇酸鈉、亞硫酸氫鈉等能避免外界有毒物質對細胞的毒害侵蝕。