[發明專利]一種測定包含氨基酸的肌肽中肌肽含量的方法

在審

• 申請號: 202111575002.X
• 申請日: 2021-12-21
• 公開（公告）號: CN116298040A
• 公開（公告）日: 2023-06-23
• 發明（設計）人: 喬莉蘋;于魯孟;周寧;羅月;郭學平
• 申請（專利權）人: 華熙生物科技股份有限公司;華熙生物科技（天津）有限公司
• 主分類號: G01N30/88
• 分類號: G01N30/88
• 代理公司: 北京唐頌永信知識產權代理有限公司 11755
• 代理人: 劉偉

本發明提供了一種測量肌肽中的L?組氨酸和β?丙氨酸的含量的方法，包括配制待測樣品和氨基酸標準品以及肌肽的標準品；使用高效液相色譜法，以無機和有機溶液的混合液為流動相，使用外標法來計算所述待測樣品中肌肽以及氨基酸的含量。本發明所提供的測量方法可以很好的實現肌肽、L?組氨酸、β?丙氨酸的基線分離，測定含量準確，回收率高，檢測限低。

技術領域

本發明涉及檢測領域，具體涉及一種測定包含氨基酸的肌肽中肌肽含量的方法。

背景技術

1900年，俄國學者Gulewitsch最早發現了肌肽。他從Liebig的肉提取物中分離了肌肽，后來被證實這種物質的結構為β-丙氨酰-L-組氨酸。這是從天然原料中分離得到的第一個具有代表性的生物活性肽。

L-肌肽(β-丙氨酰-L-組氨酸)及其類似物(如高肌肽和鵝肌肽)，廣泛存在于機體組織的細胞內，在肌肉和中樞神經系統表達最高，在脊椎動物骨骼中，肌肽的含量約為1.6～20.6μmol/g，在豬肉、牛肉和雞肉中的含量分別為4.8、2.0和15.0mmol，在人體肌肉中的含量為2～20mmol。隨著對肌肽的深入研究，學者們紛紛研究了肌肽的生物學特性。迄今為止，L-肌肽的許多生物學活性已被證實，如生理pH緩沖作用、螯合金屬離子、清除自由基、抗氧化、防止蛋白質糖化、抗衰老、抗炎以及抗腫瘤等。由于其抗氧化的活性強，毒副作用低并具有多種生理活性，肌肽及其衍生物在醫藥、保健、衛生、化妝品等領域已有廣泛的應用，市場空間廣闊。

目前L-肌肽的生產主要采用化學合成法。已有的化學合成方法比較多，例如，利用β-丙氨酸經氨基保護、羧基活化后與保護的L-組氨酸縮合，然后脫掉保護基團得到L-肌肽；L-組氨酸先與不同的β-丙氨酸前體生成肽鍵，再進一步轉換為肌肽；采用氨肽酶催化β-丙氨酸甲酯與L-組氨酸一步合成L-肌肽(申請公布號為CN107217048A的專利文獻)等。在各種合成方法中，不可避免的會導致L-肌肽反應料液中殘存未反應的L-組氨酸和β-丙氨酸，或者合成的L-肌肽經過酶的降解又分解為L-組氨酸和β-丙氨酸，嚴重影響了最終L-肌肽的得率和純度。

現有文獻對肌肽和氨基酸的分離報道極少，文獻報道其他氨基酸、氨基酸與多肽之間的分離主要采用離子交換法，將混合溶液除酸或中和至pH降至氨基酸、多肽的等電點以下后除鹽，再用陽離子交換樹脂吸附其中絕大部分堿性氨基酸和部分中性氨基酸，利用梯度洗脫，分別得到單一的氨基酸和多肽。但由于組氨酸的等電點為7.6，肌肽的等電點為7.0，兩者的等電點非常接近，導致交叉洗脫較為嚴重，肌肽的純度低、收率低，大大降低了整個工藝過程的分離效果。文獻CN202010513278.4中公開了一種肌肽和組氨酸的分離方法，色譜柱采用C18，流動相采用癸烷磺酸鈉緩沖溶液(取癸烷磺酸鈉1.22g、磷酸氫二鉀11.41g溶于1000mL去離子水中，并以磷酸溶液調節PH至3.0即得)：乙腈＝78：22(v/v)；流速為1.0mL/min，檢測器為紫外檢測器，波長為215nm。但流動相配制方法繁瑣，且癸烷磺酸鈉有一定的毒性，對實驗操作者及環境具有一定的危害，此外沒有涉及同時檢測L-組氨酸和β-丙氨酸的方法。

因此需要一種簡單、快捷、準確度高的檢測方法可同時測定L-肌肽、L-組氨酸和β-丙氨酸的含量，從而為提高肌肽的純度提供數據支持。

發明內容

針對現有技術存在的L-肌肽、L-組氨酸和β-丙氨酸檢測方法缺失，本發明提供了一種L-肌肽、L-組氨酸和丙氨酸同時檢出的高效液相色譜檢測方法。

為了解決上述技術問題，本發明采用的技術方案是：

1.一種測定包含氨基酸的肌肽中肌肽含量的方法，其包括：

配制待測樣品和氨基酸標準品以及肌肽的標準品；

使用高效液相色譜法，以無機和有機溶液的混合液為流動相，使用外標法來計算所述待測樣品中肌肽以及氨基酸的含量。

2.根據項1所述的方法，其中，所述氨基酸包括L-組氨酸和β-丙氨酸，所述肌肽為L-肌肽。