[發明專利]一種SARS-CoV-2病毒序列的高保真檢測方法

在審

• 申請號: 202111566328.6
• 申請日: 2021-12-21
• 公開（公告）號: CN116334303A
• 公開（公告）日: 2023-06-27
• 發明（設計）人: 鄒振;楊樸真;左琴
• 申請（專利權）人: 長沙理工大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6816;G01N21/64
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

新型冠狀病毒肺炎（COVID?19）的持續暴發流行給全球公共衛生帶來了挑戰。嚴重急性呼吸綜合征冠狀病毒2（SARS?CoV?2）核酸檢測是確診COVID?19和防控疫情的主要方法。在臨床實踐過程中，假陰性結果會影響臨床診療，造成疫情擴散；而假陽性結果會造成不必要的社會恐慌。如何提高SARS?CoV?2核酸檢測的精準度是疫情防控的關鍵。本發明公開了一種新型冠狀病毒冠病毒SARS?CoV?2擴增后序列的高保真檢測方法。針對傳統信號報告探針只能檢測單一擴增產物的缺陷，設計了可同時識別兩種同源序列的三鏈核酸分子開關，用以提高檢測的特異性和檢測效率。該分子開關的兩個環部設計為新冠病毒同源靶標序列，莖部為T?A·T，C?G·C組成的三鏈結構。當分子開關與新型冠狀病毒的兩段同源序列擴增產物進行邏輯識別后，三鏈分子開關發生構型重構，產生新的芘激發二聚體熒光。該分子開關可以同時檢測SARS?CoV?2的兩條同源序列，有效避免了假陽性信號，具有設計簡單，成本低，準確度高等優點。

技術領域

本發明屬于病毒核酸檢測領域，尤其涉及一種核酸分子開關用于SARS-CoV-2病毒序列的高保真識別檢測。

背景技術

COVID-19是由嚴重急性呼吸系統綜合癥冠狀病毒2(SARS-CoV-2)引起的傳染病。由于SARS-CoV-2病毒是一種RNA病毒，主要由遺傳物質單鏈RNA、核殼體、磷脂雙層、蛋白質等組成。由于病毒變異傳播迅速，迫切需要一種全面的檢測方法來快速準確地從大量人群中識別感染者，以迅速隔離感染者，從而遏制SARS-CoV-2的傳播。

目前，血清學和病毒核酸檢測是COVID-19診斷的兩類常用方法。血清學檢測直接檢測抗體或抗原性病毒蛋白，可快速獲得結果。但在大多數情況下，它們只能達到二分之一到四分之三的正確率。逆轉錄聚合酶鏈反應(RT-PCR)是判斷COVID-19感染和檢測SARS-CoV-2?病毒核酸序列的標準方法，其相對血清檢測更加準確，也被認為是確診的“金標準”。根據《新型冠狀病毒感染的肺炎實驗室檢測技術指南(第八版)》，核酸檢測方法主要針對新型冠狀病毒基因組中開放讀碼框1ab(open?reading?frame?1ab,ORF1ab)和核殼蛋白(nucleocapsid?protein，N)。在實驗室要確認一個病例為陽性，必須滿足同一份標本中新型冠狀病毒2個靶標(ORF1ab、N)特異性實時熒光RT-PCR檢測結果均為陽性。然而，目前ORF1ab和N序列的擴增和熒光信號轉導過程是相對獨立的，由于交叉污染、非特異性擴增等原因，容易造成假陽性或單基因陽性，造成不必要的社會恐慌。此外，等溫擴增技術作為一種核酸分子診斷技術，具有擴增效率高、反應時間短等優點，從誕生之日起就不斷受到研究者的青睞。例如馮雁等(SARS-CoV-2病毒核酸等溫快速檢測試劑盒及檢測方法，中國專利，公開號?CN111926117A)對靶標核酸分子進行逆轉錄環介導等溫擴增反應(逆轉錄LAMP)，然后利用?Ago酶的特性，開發了一種針對靶標核酸分子(比如新冠病毒SARS-CoV-2的靶標核酸分子)?的靈敏度高、操作簡便、檢測成本低、耗時短、準確性高的核酸檢測方法。例如候鐵英等(一種封閉式SARS-CoV-2等溫擴增核酸檢測試劑盒，中國專利，公開號CN111270014A)利用環介導等溫擴增技術擴增靶基因的特定區域，發明了一種對SARS-CoV-2一步法可視化即時篩查的試劑盒,該試劑盒能排除其他冠狀病毒株的非特異性干擾。還比如譚蔚泓院士課題組建立了一種逆轉錄環介導等溫擴增方法，通過整合核酸的直接提取、快速擴增和通過試紙條分析方便地讀出結果，為快速診斷提供了一種替代途徑。江西省科學院微生物研究所報道了一種環介導等溫擴增技術，該技術通過BstDNA聚合酶的鏈置換功能以及InterPrimer和Outer?Primer?的相互作用，最終達到對目的片段進行大量擴增。但是，等溫擴增技術在實際樣本檢測的過程中，由于對引物的要求特別高、敏感性較強，限制性內切酶引起非特異性切割、堿基錯配延伸概率增高等問題，使得其實際應用范圍變窄，未能真正顯示出其檢測優勢。因此，設計簡單，準確度高，能夠對新冠病毒ORF1ab和N序列序列進行同時檢測成為需求。本發明公開了一種新型冠狀病毒冠病毒SARS-CoV-2擴增后序列的高保真檢測方法。針對傳統信號報告探針只能檢測單一擴增產物的缺陷，設計了可同時識別兩種同源序列的三鏈核酸分子開關，用以提高檢測的特異性和檢測效率，有效避免了假陽性信號。