[發明專利]一種巖藻糖糖蛋白熒光顯色載體的制備方法、熒光強度參考載體的制作方法及用途

在審

• 申請號: 202111562311.3
• 申請日: 2021-12-20
• 公開（公告）號: CN114236138A
• 公開（公告）日: 2022-03-25
• 發明（設計）人: 楊霜;楊澤亞;楊澤人
• 申請（專利權）人: 楊霜
• 主分類號: G01N33/68
• 分類號: G01N33/68;G01N33/58;G01N33/574
• 代理公司: 蘇州翔遠專利代理事務所(普通合伙) 32251
• 代理人: 陸金星

1.一種巖藻糖糖蛋白熒光顯色載體的制備方法，其特征在于，包括步驟：

1)在載體表面共價結合凝集素；

2)對體液糖蛋白提取并用熒光標記糖蛋白；

3)將熒光標記的糖蛋白與固定有凝集素的載體結合，在其表面形成凝集素與巖藻糖的親和結合。

2.根據權利要求1所述的一種巖藻糖糖蛋白熒光顯色載體的制備方法，其特征在于，在步驟1)中，所述在載體表面共價結合凝集素包括：

將載體浸入含有氧化劑的緩沖溶液中，在室溫下反應，使得所述載體上的葡萄糖中的鄰位二羥基被氧化形成兩個醛基；

將所述載體取出，浸泡在NaCl溶液中振蕩清洗，取出后再浸泡在去離子水中振蕩清洗，最后將所述載體取出；

將所述載體在含有凝集素的PBS溶液中反應；

在所述含有凝集素的PBS溶液中加入氰基硼氫化鈉，輕微振蕩，室溫反應得到凝集素載體；

將所述凝集素載體依次浸入NaCl溶液、ACN溶液和去離子水中清洗，獲得表面具有巖藻糖凝集素的載體。

3.根據權利要求2所述的一種巖藻糖糖蛋白熒光顯色載體的制備方法，其特征在于：所述載體為試紙或球狀樹脂，當選擇所述試紙作為載體時，所述試紙具有纖維素，當選擇所述球狀樹脂作為載體時，所述球狀樹脂具有醛基。

4.根據權利要求2所述的一種巖藻糖糖蛋白熒光顯色載體的制備方法，其特征在于：所述氧化劑為高碘酸鈉，所述氧化劑在所述緩沖溶液中的濃度為5-20mM，所述緩沖溶液為90-100mM的醋酸鈉。

5.根據權利要求2所述的一種巖藻糖糖蛋白熒光顯色載體的制備方法，其特征在于：所述凝集素為LCA、UEAI或AAL中的任意一種或多種。

6.根據權利要求2所述的一種巖藻糖糖蛋白熒光顯色載體的制備方法，其特征在于，在步驟2)中，所述對體液糖蛋白提取并用熒光標記糖蛋白包括步驟：

采集體液，并放置于離心管內；

在所述體液中加入乙醇，通過沉淀法提取所述體液中的蛋白質；

將所述蛋白質重新溶解于二異丙基乙胺中，并混合均勻，獲得樣本；

在所述樣本中加入與所述蛋白質重量比相等的熒光標記試劑，并在室溫下反應，獲得具有熒光標記的糖蛋白溶液。

7.根據權利要求6所述的一種巖藻糖糖蛋白熒光顯色載體的制備方法，其特征在于，在步驟3)中，所述將熒光標記的糖蛋白與固定有凝集素的載體結合，在其表面形成凝集素與巖藻糖的親和結合包括步驟：

(1)用所述具有熒光標記的糖蛋白溶液將所述表面具有巖藻糖凝集素的載體浸濕，在室溫下培育，使得凝集素與巖藻糖充分結合；

(2)當所述表面具有巖藻糖凝集素的載體上具有一種凝集素時，用凝集素緩沖液清洗；當所述表面具有巖藻糖凝集素的載體上具有多種凝集素時，用至少一種洗脫液洗脫凝集素結合糖蛋白，使得所述表面具有巖藻糖凝集素的載體上保留至少一種凝集素結合糖蛋白；

(3)將所述表面具有巖藻糖凝集素的載體依次浸入NaCl水溶液、ACN溶液和去離子水中，輕微振蕩，將非親水結合的非巖藻糖糖蛋白洗脫；

(4)將所述表面具有巖藻糖凝集素的載體放置于熒光檢測系統，定量分析。

8.根據權利要求7所述的一種巖藻糖糖蛋白熒光顯色載體的制備方法，其特征在于，在步驟(2)中，所述凝集素緩沖液包括：LCA緩沖溶液、UEAI緩沖溶液、AAL緩沖溶液中的任意一種或多種，所述LCA緩沖溶液為10mM HEPES緩沖鹽水，pH 8.5，0.1mM CaCl₂，所述UEAI緩沖溶液為10mM HEPES緩沖鹽水，pH 8.5，0.1mM CaCl₂，所述AAL緩沖溶液為10mM HEPES緩沖鹽水，pH 8.5，0.1mM CaCl₂；所述洗脫液包括：LCA洗脫溶液、UEAI洗脫溶液和AAL洗脫溶液，所述LCA洗脫溶液為200mMα-甲基葡萄糖苷和200mMα-甲基甘露糖苷的混合物；所述UEAI洗脫溶液為50mM-100mM L-巖藻糖；所述AAL洗脫溶液為50mM-100mM L-巖藻糖。