[發明專利]一種非人哺乳動物人工輔助生殖方法

有效

• 申請號: 202111561190.0
• 申請日: 2021-12-20
• 公開（公告）號: CN113943754B
• 公開（公告）日: 2022-03-15
• 發明（設計）人: 丁方榮;王海平;王劍
• 申請（專利權）人: 北京億里生物科技發展有限公司
• 主分類號: C12N15/873
• 分類號: C12N15/873;C12N5/073;A01K67/027;G01N15/10
• 代理公司: 北京紀凱知識產權代理有限公司 11245
• 代理人: 莫舒穎

本發明提供了一種非人哺乳動物人工輔助生殖方法。本發明的方法包括以非人哺乳動物卵母細胞膜電位值X判定體外成熟非人哺乳動物卵母細胞質量。實驗發現不同膜電位非人哺乳動物卵母細胞，其后續發育潛能具有顯著性差異，因此推斷，非人哺乳動物卵母細胞成熟后膜電位與非人哺乳動物卵母細胞成熟質量及后續發育潛能具有相關性，成熟后非人哺乳動物卵母細胞的膜電位可以作為非人哺乳動物卵母細胞成熟質量及后續發育潛能的一個重要判定指標。膜電位數值為負值，且在?30～?10 mV之間的牛卵母細胞，質量最好，后續受精發育和核移植胚胎發育率最高。

技術領域

本發明屬于生物醫藥技術領域，具體涉及一種非人哺乳動物人工輔助生殖方法。

背景技術

非人哺乳動物卵母細胞體外培養的成熟是動物人工輔助生殖技術中非常重要一個技術環節，隨著體外受精、核移植等胚胎工程技術的研究和應用越來越廣泛，非人哺乳動物卵母細胞體外培育的質量是決定胚胎生物工程研究和應用成敗的關鍵前提因素之一。

在合子形成過程中，精子和卵細胞都提供了遺傳物質。除此之外，卵細胞還為早期胚胎的發育提供了大量必需的營養物質。因而，作為受精卵發育基礎，非人哺乳動物卵母細胞質量的高低直接關系到合子發育甚至是新生個體一生的命運。大量的試驗研究也表明，非人哺乳動物卵母細胞質量的好壞將直接影響卵細胞的受精率、受精卵的卵裂率、早期胚胎的存活、妊娠的建立和維持、胎兒的發育，甚至成年后的健康問題。選擇高質量非人哺乳動物卵母細胞對于輔助生殖及體細胞克隆等技術來說至關重要，而如何來評價非人哺乳動物卵母細胞的質量則成了輔助生殖技術領域及繁殖科學面臨的一個關鍵問題之一。

長期以來，評價非人哺乳動物卵母細胞質量的標準是形態學指標。90年代中期，評價非人哺乳動物卵母細胞的質量除了形態學指標以外，附以體外發育（培養）、差異性細胞染色、熒光代謝探針、胚胎代謝的顯微分析等評價方法。到目前為止，判斷非人哺乳動物卵母細胞及早期胚胎質量的標準仍然以形態學指標為主。實踐證明，這一指標是不可靠的。因為，形態正常的卵及胚胎經過移植以后并非都能得到較高的成活率。這說明形態學指標在評價非人哺乳動物卵母細胞及早期胚胎質量方面的局限性。近年來的研究表明，在非人哺乳動物卵母細胞的發育過程中非人哺乳動物卵母細胞的膜起著至關重要的作用，隨著非人哺乳動物卵母細胞的發育，非人哺乳動物卵母細胞的膜電位也隨之而自發變化。大量實驗證明，非人哺乳動物卵母細胞成熟與排卵和卵泡細胞膜電位密切相關，非人哺乳動物卵母細胞成熟后，非人哺乳動物卵母細胞膜去極化，阻斷非人哺乳動物卵母細胞的成熟， 去極化也相應消失。因此， 膜電位是非人哺乳動物卵母細胞成熟和受精的電生理學標志， 是判斷非人哺乳動物卵母細胞功能正常與否的可靠指標。

非人哺乳動物卵母細胞膜電位研究可以追溯到1946年，海星等海生小動物卵細胞受精時膜上離子通道的變化。海星的無成熟卵電壓依賴式電流分3個階段：Ca²⁺內流，短暫的快K⁺電流和內向K⁺整流電流。在激素誘發成熟期間，電流逐漸發生變化：Ca²⁺內流增大，K⁺整流電流減小， 膜的傳導性降低， 成熟期間Na⁺、K⁺轉運造成膜去極化。早在1985 年和1994年Moreau和Dale就分別對非人哺乳動物卵母細胞的膜電位進行了研究。他們認為，非人哺乳動物卵母細胞成熟的標志之一就是膜電位變化。對于多數細胞來說，膜電位是穩定的直流電位，只要細胞維持正常的新陳代謝，該電位就穩定在某一相對穩定的水平。非人哺乳動物卵母細胞則不然，因為非人哺乳動物卵母細胞是高度特化的細胞，其主要功能是維持受精和胚胎發育，其內部的代謝活動自發變化而產生某種內源性刺激，膜電位也隨之而自發變化。研究證明，所有動物的質膜上都有離子通道，在卵泡發育和受精過程中細胞膜逐漸去極化，是由于膜上離子通道的通透性發生了改變。取決于細胞內Ca²⁺的水平，細胞內Ca²⁺濃度升高引起細胞膜去極化，Ca²⁺是第二信使。

發明內容