[發明專利]表達PMT蛋白的培養基及培養方法

在審

• 申請號: 202111555625.0
• 申請日: 2021-12-17
• 公開（公告）號: CN114015628A
• 公開（公告）日: 2022-02-08
• 發明（設計）人: 李國強;孫韞博;李海超
• 申請（專利權）人: 河南興華生物技術有限公司
• 主分類號: C12N1/20
• 分類號: C12N1/20;C07K14/245;C12R1/19
• 代理公司: 北京集佳知識產權代理有限公司 11227
• 代理人: 李婉

1.發酵培養基，其特征在于，包括10～15g/L蔗糖，20～25g/L多價蛋白胨，20～25g/L酵母粉，5～10g/L KH₂PO₄，4～8g/L MgSO₄。

2.如權利要求1所述的發酵培養基，其特征在于，還包括消泡劑。

3.如權利要求2所述的發酵培養基，其特征在于，所述消泡劑的體積百分含量為0.02％-0.03％。

4.培養基組合，其特征在于，包括如權利要求1至3任一項所述的發酵培養基以及種子培養基。

5.如權利要求4所述的培養基組合，其特征在于，所述種子培養基包括甘油5g/L，胰蛋白胨12g/L，酵母浸粉24g/L，KH₂PO₄ 2.31g/L，K₂HPO₄16.43g/L，pH調至7.5。

6.如權利要求1至3任一項所述的發酵培養基、如權利要求4或5所述的培養基組合在發酵生產PMT蛋白或PMT類毒素疫苗中的應用。

7.提高菌種表達PMT蛋白的培養方法，其特征在于，包括如下步驟：

步驟1：挑取菌種接種于種子培養基，進行種子培養；

步驟2：取步驟1制得的種子液接種于發酵培養基，進行發酵培養，收集培養液；

所述種子培養基包括甘油5g/L，胰蛋白胨12g/L，酵母浸粉24g/L，KH₂PO₄2.31g/L，K₂HPO₄16.43g/L，pH調至7.5；

所述發酵培養基包括10～15g/L蔗糖，20～25g/L多價蛋白胨，20～25g/L酵母粉，5～10g/L KH₂PO₄，4～8g/L MgSO₄。

8.如權利要求7所述的培養方法，其特征在于，所述發酵培養包括如下步驟：

步驟A：取所述種子液，接種于所述發酵培養基，pH7.0培養，通過20～200L/Min，轉速100～800RPM維持溶氧在30～40％通氣量；待OD生長至5時降溫至25℃；

步驟B：待OD至7時，經第一次誘導，維持溶氧在60％以上，一次誘導2h后進行第二次誘導；甘油用溶氧反饋補加方式每次補加0.5％。

9.如權利要求/所述的培養方法，其特征在于，所述發酵培養具體包括如下步驟：

步驟A：取所述種子液，接種于所述發酵培養基，37℃培養，pH7.0，罐壓0.02MPa，初始通氣量20L/min，轉速100rpm，校正溶氧100％，待溶氧下降至20％后，轉速提升至400RPM之后，通氣量20～200L/Min，轉速100～800RPM維持溶氧在30～40％通氣量；待OD生長至5時降溫至25℃；

步驟B：待OD至7時，加入0.2mmol/L IPTG進行第一次誘導，維持溶氧在60％以上，一次誘導2h后加0.2mmol/L IPTG進行第二次誘導；

溶氧自然回升10％和/或每次誘導時一次性補加0.5％甘油；

批次甘油總消耗量約為2％左右。

10.如權利要求8或9所述的培養方法，其特征在于，所述種子培養包括一級培養和二級培養；

所述一級培養包括如下步驟：在平板上將1環菌落(每環5-10個單菌落)接種200ml所述種子培養基，于37℃、145rpm培養8h，種子OD₆₀₀生長至3～4，pH6.4～6.7，鏡檢無雜菌，菌體處于對數生長中期達到移種條件；

所述二級培養包括如下步驟：按照5％接種量(活菌數40億cfu/ml)接入上述發酵培養基，于37℃、145rpm培養14h，種子OD 2.5～3.5，pH 6.7-6.9，鏡檢無雜菌，菌體處于對數生長中期達到移種條件。