[發(fā)明專利]一種紫心甘薯IbDRM基因及其應(yīng)用

有效

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111549098.2
• 申請(qǐng)日: 2021-12-17
• 公開（公告）號(hào): CN114134158B
• 公開（公告）日: 2022-10-28
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 付丹文;齊永文;樊麗娜
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣東省科學(xué)院南繁種業(yè)研究所
• 主分類號(hào): C12N15/29
• 分類號(hào): C12N15/29;C12N15/84;C12N15/11;C12Q1/6895;C07K14/415;A01H5/00;A01H6/00
• 代理公司: 廣州科粵專利商標(biāo)代理有限公司 44001
• 代理人: 陳潔娣

本發(fā)明公開了一種紫心甘薯IbDRM基因及其應(yīng)用。本發(fā)明以紫心甘薯品系“A5”為實(shí)驗(yàn)材料，克隆了IbbHLH2的啟動(dòng)子序列，通過酵母單雜交文庫篩選實(shí)驗(yàn)，獲得了IbbHLH2基因的上游調(diào)控因子IbDRM。運(yùn)用酵母單雜交回轉(zhuǎn)實(shí)驗(yàn)和雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測(cè)證實(shí)，IbbHLH2啟動(dòng)子與上游調(diào)控因子IbDRM之間存在相互作用。通過酵母雙雜交和雙分子熒光互補(bǔ)實(shí)驗(yàn)，研究了調(diào)控因子之間的相互作用，結(jié)果顯示，IbDRM與IbEBF2、IbERF73存在相互作用。本發(fā)明在理論上可以豐富和深化植物花色素苷生物合成分子調(diào)控的基礎(chǔ)理論，還可望為提高紫心甘薯塊根中色素含量的栽培措施提供新的思路和線索。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及植物遺傳與變異的分子機(jī)制領(lǐng)域，具體涉及一種紫心甘薯IbDRM基因及其應(yīng)用。

背景技術(shù)

由于植物花色素苷的分子量較小，其化學(xué)結(jié)構(gòu)的解析相對(duì)容易，同時(shí)不同的代謝產(chǎn)物可呈現(xiàn)不同的顏色，因此植物花色素苷合成的調(diào)控機(jī)制和信號(hào)傳遞過程已成為研究植物基因表達(dá)與調(diào)控以及基因與環(huán)境相互作用的理想系統(tǒng)。目前，對(duì)于植物的花、果、莖、葉等地上部分花色素苷合成以及環(huán)境信號(hào)因子影響的分子機(jī)制有了一定的認(rèn)識(shí)，尤其是光照對(duì)花色素苷合成的調(diào)控機(jī)制及信號(hào)傳導(dǎo)過程已比較清楚。然而，對(duì)于非依光型或無法直接接受光照的植物根、塊根或塊莖中花色素苷合成調(diào)控機(jī)制及信號(hào)傳遞過程卻不甚明了。

紫心甘薯因其塊根中的薯肉富含花青素呈紫色而得名，是一種特用型甘薯品種類型。以紫心甘薯作為試驗(yàn)材料，研究植物地下器官花色素苷生物合成調(diào)控機(jī)制具有明顯的特色和優(yōu)勢(shì)：1)紫色甘薯塊根中的花青素含量很高，而莖和葉中的含量較低，有的株系甚至僅在塊根專一性地積累花青素。2)紫心甘薯的根或塊根生長于土壤中，處于完全遮光狀態(tài)，但其根或塊根內(nèi)部卻能大量積累花青素，其花青素積累部位具有一定的特殊性。3)在紫心甘薯中已發(fā)現(xiàn)塊根色素含量和分布不同的多個(gè)品系，資源頗為豐富。4)雖然不同品種紫色甘薯塊根中的花青素含量主要是由其基因型所決定，但研究發(fā)現(xiàn)栽培條件對(duì)其也有一定影響。

紫心甘薯作為花色素苷合成和積累部位特殊及具有重要開發(fā)價(jià)值的植物資源，用其進(jìn)行非依光型及植物地下部分花色素苷合成的調(diào)控機(jī)制研究，在理論上可以豐富和深化植物花色素苷生物合成分子調(diào)控的基礎(chǔ)理論；在應(yīng)用上可以為紫心甘薯高花色素苷品種選育提供新的遺傳標(biāo)記，為其分子育種篩選出合適的操作元件或改造靶標(biāo)，同時(shí)還可望為提高紫心甘薯塊根中色素含量的栽培措施提供新的思路和線索。

在紫心甘薯中克隆獲得了轉(zhuǎn)錄因子IbbHLH2的基因序列，IbbHLH2基因能夠調(diào)控花色素苷合成途徑中關(guān)鍵酶基因的表達(dá)，進(jìn)而影響紫心甘薯中花色素苷的積累。進(jìn)一步研究表明不同甘薯品種(系)及其根發(fā)育時(shí)期中，IbbHLH2基因的表達(dá)與花色素苷的合成積累是完全同步的，說明IbbHLH2是紫心甘薯花色素苷合成代謝中的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子。由于植物花色素苷的分子量較小，其化學(xué)結(jié)構(gòu)的解析相對(duì)容易，同時(shí)不同的代謝產(chǎn)物可呈現(xiàn)不同的顏色，因此植物花色素苷合成的調(diào)控機(jī)制和信號(hào)傳遞過程已成為研究植物基因表達(dá)與調(diào)控以及基因與環(huán)境相互作用的理想系統(tǒng)。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術(shù)問題在于篩選紫心甘薯IbbHLH2表達(dá)的上游調(diào)控因子以及研究上游調(diào)控因子之間的相互作用。

為了解決上述技術(shù)問題，本發(fā)明首先用Trizol法從甘薯塊根提取RNA，用SMART技術(shù)逆轉(zhuǎn)錄合成雙鏈的cDNA，構(gòu)建紫心甘薯酵母單雜交cDNA文庫。

進(jìn)一步的，以紫心甘薯塊根DNA為模板，用TaKaRa高保真酶Max DNAPolymerase擴(kuò)增兩端帶有不同酶切位點(diǎn)末端的IbbHLH2的啟動(dòng)子DNA片段，并將啟動(dòng)子IbbHLH2構(gòu)建到pAbAi載體中，擴(kuò)增IbbHLH2的啟動(dòng)子DNA片段的PCR引物對(duì)的具體序列如下所示：

PIbbHLH2-F：5'-TCCTAGCCAAGAAGAGTGGAGAGA-3'和

PIbbHLH2-R：5'-TCTCATACCACCACACCCTAGTGG-3'。