[發(fā)明專利]一種紫心甘薯花色素苷合成調(diào)控因子IbEIN3-2及其應用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111549083.6
• 申請日: 2021-12-17
• 公開（公告）號: CN114133438B
• 公開（公告）日: 2022-09-06
• 發(fā)明（設計）人: 齊永文;付丹文;樊麗娜
• 申請（專利權）人: 廣東省科學院南繁種業(yè)研究所
• 主分類號: C07K14/415
• 分類號: C07K14/415;C12N15/29;C12N15/11;C12N15/84;C12Q1/6895;A01H5/00;A01H6/00
• 代理公司: 廣州科粵專利商標代理有限公司 44001
• 代理人: 陳潔娣

本發(fā)明公開了一種紫心甘薯花色素苷合成調(diào)控因子IbEIN3?2及其應用。本發(fā)明以紫心甘薯品系“A5”為實驗材料，克隆了IbMYB1的啟動子序列，通過酵母單雜交文庫篩選實驗，獲得了IbMYB1基因的上游調(diào)控因子IbEIN3?2。運用酵母單雜交回轉(zhuǎn)實驗和雙熒光素酶報告系統(tǒng)檢測證實，IbMYB1啟動子與上游調(diào)控因子IbEIN3?2之間存在相互作用。本發(fā)明在理論上可以豐富和深化植物花色素苷生物合成分子調(diào)控的基礎理論，還可望為提高紫心甘薯塊根中色素含量的栽培措施提供新的思路和線索。

技術領域

本發(fā)明涉及植物遺傳與變異的分子機制領域，具體涉及一種紫心甘薯花色素苷合成調(diào)控因子IbEIN3-2及其應用。

背景技術

甘薯是一年生或多年生的旋花科甘薯屬根莖類草本植物，是全球最重要的糧食作物之一，它已經(jīng)在100多個國家栽植。我國的甘薯種植面積達660萬公頃，產(chǎn)量為1億噸，占世界甘薯總產(chǎn)量的70％。

花青素相關的結(jié)構(gòu)基因的表達主要受到IbMYB1基因啟動子的調(diào)控。已有學者研究發(fā)現(xiàn)IbMYB1受到光、激素等環(huán)境因子的調(diào)控，但由于甘薯塊根是深埋于地下的不見光部分。IbMYB1啟動子可能受到其它還未發(fā)現(xiàn)的基因?qū)λ恼{(diào)控，從而參與花青素的合成途徑。研究發(fā)現(xiàn)，在心里美蘿卜中，RsMYB1啟動子上游存在7372bp的CACTA類型轉(zhuǎn)座子，其在心里美蘿卜肉色形成中發(fā)揮重要作用，同時高度甲基化的轉(zhuǎn)座子擴散到RsMYB1啟動子區(qū)域，使該基因的表達受到抑制，阻斷花青苷的合成，形成白肉突變體。在玉米中，MYB1啟動子和PL1蛋白相互作用，能夠使果皮和淀粉層合成花青素。在荔枝中，LcbHLH1和LcbHLH3蛋白分別與LcMYB1啟動子相互作用，調(diào)節(jié)花色素苷生物合成結(jié)構(gòu)基因DFR和ANS的表達,進而促進花色素苷的生物合成。由此可見，MYB1啟動子通過與某些蛋白相互作用，調(diào)控花青素的合成，因此尋找MYB1啟動子在花青素合成途徑中的互作蛋白具有重大意義。

轉(zhuǎn)錄因子MYB、bHLH(Basic helix-loop-helix)和WD40參與調(diào)控植物花色素苷合成。MYB常與bHLH和WD40蛋白形成“MBW”蛋白三元復合體其作用，通過形成復合體共同促進下游花色素苷合成途徑關鍵結(jié)構(gòu)基因表達，從而促進花色素苷合成。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明要解決的技術問題在于篩選紫心甘薯IbMYB1表達的上游調(diào)控因子。

為了解決上述技術問題，本發(fā)明首先用Trizol法從甘薯塊根提取RNA，用SMART技術逆轉(zhuǎn)錄合成雙鏈的cDNA，構(gòu)建紫心甘薯酵母單雜交cDNA文庫。

進一步的，以紫心甘薯塊根DNA為模板，用TaKaRa高保真酶Max DNAPolymerase擴增兩端帶有不同酶切位點末端的IbMYB1的啟動子DNA片段，并將啟動子IbMYB1構(gòu)建到pAbAi載體中，擴增IbMYB1的啟動子DNA片段的PCR引物對的具體序列如下所示：

PIbMYB1-F：5'-TATTGCTCTCAATGTGCAAGAATCA-3'和

PIbMYB1-R：5'-TTTGATACGCATACCTTATGCCTAA-3'。

構(gòu)建的pAbAi-PIbMYB1誘餌載體經(jīng)過自激活檢測后，確定其自激活AbA最低抑制濃度為300ng/mL。

本發(fā)明其次將誘餌菌株制成Y1HGold感受態(tài)細胞，把文庫質(zhì)粒轉(zhuǎn)入pAbAi-PIbMYB1感受態(tài)細胞中，通過酵母單雜交篩庫對結(jié)合蛋白進行篩選，篩選得到了紫心甘薯IbMYB1基因表達的上游調(diào)控因子為IbEIN3-2。

因此，本發(fā)明的第一個目的是提供一種紫心甘薯花色素苷合成調(diào)控因子IbEIN3-2，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

本發(fā)明的第二個目的是提供一種上述的紫心甘薯花色素苷合成調(diào)控因子IbEIN3-2的編碼基因，該編碼基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。