[發(fā)明專利]HBB基因突變細(xì)胞及其應(yīng)用

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111547513.0
• 申請(qǐng)日: 2021-12-16
• 公開（公告）號(hào): CN115011636A
• 公開（公告）日: 2022-09-06
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 孫筱放;楊影虹
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院（廣州重癥孕產(chǎn)婦救治中心;廣州柔濟(jì)醫(yī)院）
• 主分類號(hào): C12N15/87
• 分類號(hào): C12N15/87;C12N15/113;C12N9/22;C12N15/12;C12N15/10;C12N5/10;C12Q1/02
• 代理公司: 華進(jìn)聯(lián)合專利商標(biāo)代理有限公司 44224
• 代理人: 張靈莉

1.一種HBB基因突變細(xì)胞，其特征在于，所述HBB基因突變細(xì)胞的制備方法包括以下步驟：

使用RNP復(fù)合體靶向切割紅系細(xì)胞的基因組DNA的HBB基因，所述RNP復(fù)合體包括Cas9蛋白與核苷酸序列如SEQ ID NO:1所示的sgRNA；及

使用含有HBB基因CD41-42(-CTTT)突變位點(diǎn)的單鏈核苷酸對(duì)所述靶向切割后的紅系細(xì)胞的基因組DNA進(jìn)行同源重組修復(fù)，制備HBB基因突變細(xì)胞。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的HBB基因突變細(xì)胞，其特征在于，所述單鏈核苷酸的核苷酸序列如SEQ ID NO:2所示。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的HBB基因突變細(xì)胞，其特征在于，所述Cas9蛋白與sgRNA的摩爾比為(2～3)：1。

4.根據(jù)權(quán)利要求1～3任一項(xiàng)所述的HBB基因突變細(xì)胞，其特征在于，所述RNP復(fù)合體和所述單鏈核苷酸通過(guò)電穿孔法轉(zhuǎn)染進(jìn)入所述紅系細(xì)胞。

5.根據(jù)權(quán)利要求4所述的HBB基因突變細(xì)胞，其特征在于，所述RNP復(fù)合體、所述單鏈核苷酸與所述紅系細(xì)胞的比例為1nmol：(20nmol～100nmol)：(0.5×10⁵個(gè)～2.5×10⁵個(gè))。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的HBB基因突變細(xì)胞，其特征在于，所述電穿孔法采用的參數(shù)包括：電壓1000V～1800V，方波脈沖寬度5ms～25ms，方波脈沖次數(shù)2次～4次。

7.根據(jù)權(quán)利要求1～3和5～6中任一項(xiàng)所述的HBB基因突變細(xì)胞，其特征在于，所述紅系細(xì)胞為HUDEP-2細(xì)胞。

8.如權(quán)利要求1～7任一項(xiàng)所述的HBB基因突變細(xì)胞在鑒別和/或測(cè)試藥物中的用途，所述藥物用于預(yù)防和/或治療β-地中海貧血和/或β-地中海貧血相關(guān)的并發(fā)癥。

9.一種制備HBB基因突變細(xì)胞的試劑盒，其特征在于，包括Cas9蛋白、核苷酸序列如SEQID NO:1所示的sgRNA和含有HBB基因CD41-42(-CTTT)突變位點(diǎn)的單鏈核苷酸。

10.根據(jù)權(quán)利要求9所述的試劑盒，其特征在于，所述單鏈核苷酸的核苷酸序列如SEQID NO:2所示。