[發(fā)明專利]基于CRISPR-Cas反式切割和gFET核酸檢測(cè)

在審

• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111543506.3
• 申請(qǐng)日: 2021-12-16
• 公開（公告）號(hào): CN114150089A
• 公開（公告）日: 2022-03-08
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 符汪洋;秦怡;經(jīng)求是;王乾龍;張曉艷
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 清華大學(xué)
• 主分類號(hào): C12Q1/70
• 分類號(hào): C12Q1/70;C12Q1/6837
• 代理公司: 北京眾合誠(chéng)成知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 11246
• 代理人: 陳波

本發(fā)明公開了一種基于CRISPR?Cas13a/Cas12a反式切割和石墨烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管的核酸檢測(cè)方法，將Cas13a/Cas12a固定在石墨烯表面后或者在溶液中與靶向不同病毒核酸的crRNA結(jié)合，構(gòu)建Cas13a/Cas12a?crRNA復(fù)合物，用于快速切割修飾在gFET上的ssRNA/ssDNA，進(jìn)而引發(fā)轉(zhuǎn)移特性曲線的變化，實(shí)現(xiàn)對(duì)多種病毒核酸的響應(yīng)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明涉及生物檢測(cè)技術(shù)領(lǐng)域，特別是涉及一種基于CRISPR-Cas13a/Cas12a反式切割和石墨烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管的核酸檢測(cè)方法。

背景技術(shù)

針對(duì)病毒感染及疾病診斷，快速靈敏的核酸檢測(cè)技術(shù)十分關(guān)鍵。目前，RT-qPCR是核酸檢測(cè)的金標(biāo)準(zhǔn)，該方法可實(shí)現(xiàn)高靈敏、高特異的疾病診斷。但是，RT-qPCR的檢測(cè)過(guò)程需要專業(yè)人員進(jìn)行多步的樣品處理和控溫設(shè)備進(jìn)行多個(gè)周期的反應(yīng)，限制了RT-qPCR在現(xiàn)場(chǎng)檢測(cè)中的應(yīng)用。

近年來(lái)，CRISPR-Cas系統(tǒng)由于其多樣性和Cas蛋白特殊的核酸酶活性，在生物傳感器的開發(fā)中展現(xiàn)出巨大的潛力。其中，Cas12a和Cas13a具有獨(dú)特的反式切割活性，近年來(lái)被廣泛地應(yīng)用于生物傳感領(lǐng)域。目前，基于Cas12a/Cas13a的高靈敏核酸檢測(cè)方式主要依賴于核酸等溫?cái)U(kuò)增技術(shù)，但存在反應(yīng)系統(tǒng)復(fù)雜、檢測(cè)時(shí)間長(zhǎng)以及樣品易污染等問(wèn)題。因此，亟待開發(fā)一種無(wú)擴(kuò)增、高靈敏的單分子檢測(cè)方式。

石墨烯具有比表面積大、無(wú)懸掛鍵、載流子濃度和載流子遷移率高、能帶結(jié)構(gòu)易于調(diào)節(jié)等特點(diǎn)，使其表面易于感知微小的電荷變化。石墨烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管(gFET)傳感器是以石墨烯為溝道材料制作的場(chǎng)效應(yīng)晶體管器件，待檢DNA與固定于石墨烯表面的互補(bǔ)DNA雜交實(shí)現(xiàn)核酸檢測(cè)，但其檢測(cè)靈敏度仍有待進(jìn)一步提高。

發(fā)明內(nèi)容

為解決上述問(wèn)題，本發(fā)明了提供一種基于CRISPR-Cas13a/Cas12a反式切割和石墨烯場(chǎng)效應(yīng)晶體管的核酸檢測(cè)方法，Cas13a/Cas12a或游離于溶液中，或通過(guò)不同長(zhǎng)度的PEG鏈固定于石墨烯表面，不同長(zhǎng)度的PEG可以為Cas蛋白的剪切活動(dòng)提供適當(dāng)?shù)目臻g。當(dāng)目標(biāo)核酸激活Cas13a/Cas12a后，Cas13a/Cas12a可以快速切割固定于石墨烯表面的ssRNA/ssDNA，每秒鐘發(fā)生上千次的切割，導(dǎo)致gFET中源極和漏極之間電流發(fā)生快速改變，轉(zhuǎn)移特性曲線發(fā)生移動(dòng)，實(shí)現(xiàn)目標(biāo)核酸的超靈敏檢測(cè)。其中，將Cas13a/Cas12a固定于石墨烯表面，免去了蛋白擴(kuò)散到石墨烯表面的時(shí)間，使其更接近剪切目標(biāo)，實(shí)現(xiàn)更快速更靈敏的核酸檢測(cè)。

一方面，本申請(qǐng)?zhí)峁┝艘环N核酸檢測(cè)方式，其使用場(chǎng)效應(yīng)晶體管放大溶液中CRISPR-Cas13a/Cas12a反式切割的信號(hào)(如圖1)。

進(jìn)一步地，所述方法包括場(chǎng)效應(yīng)晶體管的制備步驟、報(bào)告分子修飾步驟以及核酸檢測(cè)步驟。

進(jìn)一步地，所述場(chǎng)效應(yīng)晶體管的制備步驟包括：定制商業(yè)化gFET芯片，經(jīng)引線后，構(gòu)建聚二甲基硅氧烷(PDMS)微流控腔室，將微流控腔室用環(huán)氧樹脂膠固定于芯片上，并將進(jìn)液和出液管道插入腔室，用膠封保證腔室密閉，出液管另一端與泵相連，用于液體的抽吸。

進(jìn)一步地，報(bào)告分子修飾步驟包括將PBASE溶液在石墨烯通道表面孵育1-2h、將氨基修飾的ssRNA或ssDNA溶液在石墨烯表面孵育2-12h，以及可選的用乙醇胺進(jìn)行封閉1h。

進(jìn)一步地，PBASE溶液濃度為1-3mM；和/或氨基修飾的ssRNA或ssDNA溶液濃度為1-5μM；和/或乙醇胺溶液濃度為100-500mM；

進(jìn)一步地，所述ssRNA或ssDNA的長(zhǎng)度為10-30nt的隨機(jī)序列。

進(jìn)一步地，所述PBASE溶液溶劑為乙醇或DMF。

進(jìn)一步地，所述核酸檢測(cè)步驟包括將Cas12a或Cas13a與crRNA形成復(fù)合物，將檢測(cè)樣本與復(fù)合物混合后添加到場(chǎng)效應(yīng)晶體管中，反應(yīng)后記錄轉(zhuǎn)移特性曲線的變化。