[發明專利]重組TET酶MBD3-NgTET1及其在提高TET酶氧化產物中5caC占比的應用

有效

• 申請號: 202111542338.6
• 申請日: 2021-10-18
• 公開（公告）號: CN114591441B
• 公開（公告）日: 2023-06-20
• 發明（設計）人: 侯策;韋磊;江翱;陳晶晶;黃開瑜;滕以剛;曹振;宋東亮
• 申請（專利權）人: 翌圣生物科技（上海）股份有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N9/10;C12Q1/6886
• 代理公司: 蘇州根號專利代理事務所(普通合伙) 32276
• 代理人: 朱華慶

1.一種重組TET酶MBD3-NgTET1，其特征在于：所述重組TET酶MBD3-NgTET1為序列如SEQID?No?.3所示的重組蛋白結構域MBD3通過GGGS連接肽連接序列如SEQ?ID?No?.5所示的NgTET1蛋白。

2.權利要求1所述的重組TET酶MBD3-NgTET1在制備基于TET酶氧化反應的DNA甲基化檢測試劑中的應用，其中所述重組TET酶MBD3-NgTET1催化5mC，生成氧化產物5hmC、5fC及5caC，所述重組TET酶MBD3-NgTET1相較于SEQ?ID?No?.5所示的?NgTET1蛋白提高了TET酶氧化產物中5caC的占比。

3.根據權利要求2所述的應用，其特征在于其步驟包括：

（1）采用權利要求1所述的重組TET酶MBD3-NgTET1對模板DNA進行氧化反應；

（2）還原劑處理，堿中和；

（3）DNA回收，回收產物構成全基因組DNA甲基化檢測文庫；

其中步驟（1）中添加TET酶反應緩沖液，所述TET酶反應緩沖液含有：1-100?mM?3-(N-嗎啉基)丙磺酸鈉鹽、1-100?mM雙(2-羥乙基)氨基-三(羥甲基)甲烷、1-100?mM羥乙基哌嗪乙硫磺酸、1-300?mM氯化鈉、0?.1-10?mM抗壞血酸、0?.1-10?mM檸檬酸、0?.1-20?mMα-酮戊二酸、?0?.1-20?mM?1?,3-丙酮二羧酸、0?.1-20?mM三磷酸腺苷、0?.1-10?mM四氟對苯醌、0.1-10?mM四?氯對苯醌、0?.1-10?mM四溴對苯醌、0?.1-10?mM四碘苯醌、0?.01-2?mM三(2-羧乙基)膦、0?.01-?2?mM二硫蘇糖醇。

4.根據權利要求3所述的應用，其特征在于：所述TET酶反應緩沖液還含有0?.1-50?mM的?鐵鹽化合物。

5.根據權利要求3所述的應用，其特征在于：步驟（1）中所述的氧化反應的反應溫度為10-40℃。

6.根據權利要求3所述的應用，其特征在于：步驟（1）中所述的氧化反應的反應時間為0?.5-2?h。

7.根據權利要求3所述的應用，其特征在于：步驟（2）中所述的還原劑包括氫化鋁鋰、氫化硼鋰、醋酸硼氫化鈉、氰基硼氫化鈉、二異丁基氫化鋁、三乙基硼氫化鋰、氨硼烷、吡啶硼烷、2-甲基吡啶硼烷、硼氫化鈉、氨硼烷鋰、吡咯烷并硼氫化鋰、硼烷乙二胺、硼烷二甲胺、硼烷嗎啉絡合物、硼烷三苯基膦、硼烷二苯基膦、硼烷三乙胺、4-甲基嗎啉硼烷、硼烷三甲胺絡合物、5-乙基-2-甲基吡啶硼烷、N?,N-二異丙基乙胺硼烷、硼烷四氫呋喃絡合物、硼烷二甲基?硫醚絡合物中的一種或多種。

8.根據權利要求3所述的應用，其特征在于：步驟（2）中還原劑的處理濃度為100-2000mM。

9.根據權利要求3所述的應用，其特征在于：步驟（2）中還原劑的處理溫度為20-50℃。

10.根據權利要求3所述的應用，其特征在于：步驟（2）中還原劑的處理時間為2-24?h。

11.根據權利要求3所述的應用，其特征在于：步驟（2）中所述的堿中和使用的是氫氧化鈉或氫氧化鉀，在反應體系中的終濃度為0?.5-1?.5?M。

12.根據權利要求3所述的應用，其特征在于：步驟（3）中所述的DNA回收方式指磁珠法回收、柱法回收或抽提沉淀法回收。