[發(fā)明專(zhuān)利]通過(guò)免疫標(biāo)記建立植原體在介體和植株間循回傳播的方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111542000.0
• 申請(qǐng)日: 2021-12-16
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN114354941A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-04-15
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 陸文靜;周通;吳云鋒;周建朝
• 申請(qǐng)（專(zhuān)利權(quán)）人: 黑龍江省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻研究所;黑龍江大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): G01N33/68
• 分類(lèi)號(hào): G01N33/68;G01N33/58;C12Q1/689;C12R1/01
• 代理公司: 西安鼎邁知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理事務(wù)所(普通合伙) 61263
• 代理人: 劉喜保

本發(fā)明公開(kāi)了一種通過(guò)免疫標(biāo)記建立植原體在介體和植株間循回傳播的方法。所述植原體為小麥藍(lán)矮病植原體，所述介體為異沙葉蟬；所述方法包括：在異沙葉蟬飼毒后不同時(shí)間，利用小麥藍(lán)矮植原體表面免疫膜蛋白抗體免疫標(biāo)記感染小麥藍(lán)矮植原體的異沙葉蟬組織，觀察不同時(shí)間段小麥藍(lán)矮植原體在異沙葉蟬不同組織的分布，明確循回傳播過(guò)程。本發(fā)明探明了小麥藍(lán)矮植原體在介體異沙葉蟬體內(nèi)循回傳播途徑，為后續(xù)研究病原與介體的互作奠定基礎(chǔ)。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于植物病理技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及通過(guò)免疫標(biāo)記建立植原體在介體和植株間循回傳播的方法。

背景技術(shù)

植原體是一種依賴介體昆蟲(chóng)傳播，專(zhuān)性寄生于植物韌皮部的單細(xì)胞原核生物，無(wú)細(xì)胞壁，隸屬軟壁菌門(mén)柔膜菌綱(Class Mollicutes,phylum Tenericutes)。通常發(fā)現(xiàn)一種新的植原體病害時(shí)，傳播介體的鑒定主要針對(duì)患病植物附近發(fā)現(xiàn)的昆蟲(chóng)種類(lèi)進(jìn)行，常用方法是使用粘性誘捕、網(wǎng)掃等將其捕獲，重點(diǎn)選取帶有刺吸式口器的昆蟲(chóng)進(jìn)行檢測(cè)，確定其體內(nèi)是否含有植原體。早期通過(guò)電鏡觀察昆蟲(chóng)介體中的植原體，后期隨PCR技術(shù)發(fā)展，通過(guò)提取昆蟲(chóng)DNA確定帶毒昆蟲(chóng)。

小麥藍(lán)矮病(Wheat blue dwarf disease，WBD)是我國(guó)小麥生產(chǎn)上重要病害之一。研究認(rèn)為該病害主要發(fā)生在間作套種、麥草覆蓋的旱塬地區(qū)和小麥灌溉區(qū)。小麥藍(lán)矮病的廣泛發(fā)生嚴(yán)重威脅我國(guó)小麥生產(chǎn)，是繼黃矮病后又一個(gè)重要小麥病害，引起小麥矮縮、叢枝、不育等癥狀。近些年禾稈還田面積擴(kuò)大，為傳播介體繁衍生息提供有利農(nóng)田小環(huán)境；全球溫度升高，增加了傳播介體活動(dòng)周期，各項(xiàng)因素促使介體數(shù)量急劇上升，造成病害隨介體遷飛廣泛傳播，導(dǎo)致周期性大爆發(fā)。傳毒介體的的數(shù)量決定發(fā)病程度的高低，介體傳毒成為病害流行的重要中心環(huán)節(jié)。

異沙葉蟬(Psammotettix alienusL.)是一種重要的傳播介體，危害北方丘陵旱源地區(qū)小麥、大麥、燕麥等禾本科植物。其刺吸式口針可取食小麥植株的莖、葉維管束組織，使受害部位產(chǎn)生枯黃斑點(diǎn)，從而導(dǎo)致組織大面積失綠影響植物光合作用，阻礙植物生長(zhǎng)發(fā)育。介體葉蟬能夠傳播病毒病、植原體等多種病害，目前研究較為深入的是小麥矮縮病(WDV)和小麥藍(lán)矮病(WBD)，相關(guān)研究表明一旦傳播介體大量繁殖，直接導(dǎo)致病害的大發(fā)生、大流行，嚴(yán)重影響小麥生產(chǎn)，威脅小麥糧食安全。

小麥藍(lán)矮病由異沙葉蟬專(zhuān)化性傳播，然而，小麥藍(lán)矮病與介體異沙葉蟬互作機(jī)制并不清楚，研究者普遍認(rèn)為帶毒的親代異沙葉蟬通過(guò)生殖系統(tǒng)將WBDp傳遞給子代異沙葉蟬。因此，小麥藍(lán)矮植原體(Wheat blue dwarf phytoplasma，WBDp)的侵染循回過(guò)程，以及小麥藍(lán)矮植原體經(jīng)異沙葉蟬卵傳問(wèn)題，成為探明植原體與介體互作機(jī)制的關(guān)鍵。

發(fā)明內(nèi)容

本發(fā)明目的在于揭示出小麥藍(lán)矮植原體(WBDp)在異沙葉蟬體內(nèi)傳播的途徑，為后續(xù)研究病原與介體的互作奠定基礎(chǔ)。

基于上述目的，本發(fā)明提供了一種通過(guò)免疫標(biāo)記建立植原體在介體和植株間循回傳播的方法。本發(fā)明所述方法涉及的植原體為小麥藍(lán)矮病植原體，所述介體為異沙葉蟬。本發(fā)明的技術(shù)思路在于：在異沙葉蟬飼毒后不同時(shí)間，利用小麥藍(lán)矮植原體表面免疫膜蛋白抗體免疫標(biāo)記感染小麥藍(lán)矮植原體的異沙葉蟬組織，觀察不同時(shí)間段小麥藍(lán)矮植原體在異沙葉蟬不同組織的分布，明確循回傳播過(guò)程。

進(jìn)一步地，在通過(guò)免疫標(biāo)記建立植原體在介體和植株間循回傳播的方法中，經(jīng)饑餓處理的異沙葉蟬轉(zhuǎn)移至帶有小麥藍(lán)矮病植原體的小麥上飼毒，飼毒后解剖獲取異沙葉蟬組織，所述組織為異沙葉蟬的消化道、生殖系統(tǒng)和唾液腺組織。

進(jìn)一步地，在通過(guò)免疫標(biāo)記建立植原體在介體和植株間循回傳播的方法中，所述異沙葉蟬組織采用小麥藍(lán)矮植原體表面免疫膜蛋白抗體與熒光素FITC的交聯(lián)物標(biāo)記。

WBDp不同時(shí)間在介體中的定位顯示，通過(guò)免疫標(biāo)記確定異沙葉蟬飼毒后不同時(shí)間小麥藍(lán)矮植原體分布于異沙葉蟬的消化道和唾液腺組織。