[發(fā)明專利]重組TET酶MBD4-NgTET1及其在提高TET酶氧化產(chǎn)物中5caC占比的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111541359.6
• 申請日: 2021-10-18
• 公開（公告）號: CN114591440B
• 公開（公告）日: 2023-06-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 侯策;韋磊;江翱;陳晶晶;黃開瑜;滕以剛;曹振;宋東亮
• 申請（專利權(quán)）人: 翌圣生物科技（上海）股份有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N9/10;C12Q1/6886
• 代理公司: 蘇州根號專利代理事務(wù)所(普通合伙) 32276
• 代理人: 朱華慶

1.一種重組TET酶MBD4-NgTET1，其特征在于：所述重組TET酶MBD4-NgTET1為序列如SEQID?No.4所示的重組蛋白結(jié)構(gòu)域MBD4通過GGGS連接肽連接序列如SEQ?ID?No.5所示的NgTET1蛋白。

2.權(quán)利要求1所述的重組TET酶MBD4-NgTET1在制備基于TET酶氧化反應(yīng)的DNA甲基化檢測試劑中的應(yīng)用，其中所述重組TET酶MBD4-NgTET1催化5mC，生成氧化產(chǎn)物5hmC、5fC及5caC，所述重組TET酶MBD4-NgTET1相較于SEQ?ID?No?.5所示的?NgTET1蛋白提高了TET酶氧化產(chǎn)物中5caC的占比。

3.根據(jù)權(quán)利要求2所述的應(yīng)用，其特征在于其步驟包括：

（1）采用權(quán)利要求1所述的重組TET酶MBD4-NgTET1對模板DNA進(jìn)行氧化反應(yīng)；

（2）還原劑處理，堿中和；

（3）DNA回收，回收產(chǎn)物構(gòu)成全基因組DNA甲基化檢測文庫；

其中步驟（1）中添加TET酶反應(yīng)緩沖液，所述TET酶反應(yīng)緩沖液含有：1-100?mM?3-(N-嗎啉基)丙磺酸鈉鹽、1-100?mM雙(2-羥乙基)氨基-三(羥甲基)甲烷、1-100?mM羥乙基哌嗪乙硫磺酸、1-300?mM氯化鈉、0.1-10?mM抗壞血酸、0.1-10?mM檸檬酸、0.1-20?mMα-酮戊二酸、0.1-20?mM?1,3-丙酮二羧酸、0.1-20?mM三磷酸腺苷、0.1-10?mM四氟對苯醌、0.1-10?mM四氯對苯醌、?0.1-10?mM四溴對苯醌、0.1-10?mM四碘苯醌、0.01-2?mM三(2-羧乙基)膦、0.01-2?mM二硫蘇糖醇。

4.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：所述TET酶反應(yīng)緩沖液還含有0.1-50?mM的鐵鹽化合物。

5.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：步驟（1）中所述的氧化反應(yīng)的反應(yīng)溫度為10-40℃。

6.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：步驟（1）中所述的氧化反應(yīng)的反應(yīng)時(shí)間為0.5-2?h。

7.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：步驟（2）中所述的還原劑包括氫化鋁鋰、氫化硼鋰、醋酸硼氫化鈉、氰基硼氫化鈉、二異丁基氫化鋁、三乙基硼氫化鋰、氨硼烷、吡啶硼烷、2-甲基吡啶硼烷、硼氫化鈉、氨硼烷鋰、吡咯烷并硼氫化鋰、硼烷乙二胺、硼烷二甲胺、硼烷嗎啉絡(luò)合物、硼烷三苯基膦、硼烷二苯基膦、硼烷三乙胺、4-甲基嗎啉硼烷、硼烷三甲胺絡(luò)合物、5-乙基-2-甲基吡啶硼烷、N,N-二異丙基乙胺硼烷、硼烷四氫呋喃絡(luò)合物、硼烷二甲基硫醚絡(luò)合物中的一種或多種。

8.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：步驟（2）中還原劑的處理濃度為100-2000mM。

9.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：步驟（2）中還原劑的處理溫度為20-50℃。

10.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：步驟（2）中還原劑的處理時(shí)間為2-24?h。

11.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：步驟（2）中所述的堿中和使用的是氫氧化鈉或氫氧化鉀，在反應(yīng)體系中的終濃度為0.5-1.5?M。

12.根據(jù)權(quán)利要求3所述的應(yīng)用，其特征在于：步驟（3）中所述的DNA回收方式指磁珠法回收、柱法回收或抽提沉淀法回收。