[發明專利]重組TET酶MBD2-NgTET1及其在提高TET酶氧化產物中5caC占比的應用

有效

• 申請號: 202111541338.4
• 申請日: 2021-10-18
• 公開（公告）號: CN114591439B
• 公開（公告）日: 2023-06-20
• 發明（設計）人: 侯策;韋磊;江翱;陳晶晶;黃開瑜;滕以剛;曹振;宋東亮
• 申請（專利權）人: 翌圣生物科技（上海）股份有限公司
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N9/10;C12Q1/6886
• 代理公司: 蘇州根號專利代理事務所(普通合伙) 32276
• 代理人: 朱華慶

本發明提供了增強TET酶活性的重組蛋白結構域，為DNA甲基化結合結構域（MBD），MBD1?4的氨基酸序列如SEQ?ID?1?4所示。通過MBD與TET酶融合形成的重組蛋白MBD?TET可以顯著增強TET酶包括NgTET1、mTET1CD、mTET2CDT、hTET1CD和hTET2CDT對5mC的氧化活性。此外，本發明還提供了簡便快速的高通量DNA甲基化檢測流程，提高基于TET酶氧化反應的DNA甲基化檢測技術的靈敏度和準確性。

本申請是于2021年10月18日提交的申請號為202111207210.4、名稱為“重組蛋白結構域及其編碼DNA、增強TET酶及全基因組DNA甲基化檢測方法”的專利申請的分案申請。

技術領域

本發明專利涉及重組蛋白結構域及其編碼DNA、增強TET酶及全基因組DNA甲基化檢測方法，屬于生物技術領域。

背景技術

DNA胞嘧啶甲基化（5mC）是DNA中最常見的堿基修飾方式，約占所有胞嘧啶的1%-8%，被稱為“第五種堿基”。DNA甲基化與染色質狀態和基因轉錄活躍程度具有明顯的相關性，是預測基因表達水平的有效依據。因此，DNA甲基化水平檢測是臨床疾病診斷的有效手段。現有的DNA甲基化檢測技術主要是依賴于反向篩選的重亞硫酸鹽轉化法，其原理是利用重亞硫酸鹽將未甲基化的胞嘧啶轉變成尿嘧啶，再通過PCR擴增轉變成胸腺嘧啶。這種方法具有DNA損傷大、背景噪音高和準確性低等缺陷。近年來，酶轉化法甲基化檢測技術因為具備DNA損傷小、背景噪音低、準確性高和數據質量好等優點而成為DNA甲基化檢測領域的重要關注點。

DNA羥甲基化酶TET是真核生物中普遍存在的一種α-酮戊二酸（α-KG）和Fe2+依賴的雙加氧酶，在生物進化過程中具有高度的保守性。TET酶是DNA去甲基化過程的關鍵蛋白，可以將5mC通過三步氧化反應（5mC-5hmC-5fC-5caC）轉變成5caC。目前的酶轉化法DNA胞嘧啶甲基化檢測技術都是依賴于TET酶催化甲基化胞嘧啶的能力，TET蛋白是酶轉化法DNA甲基化檢測技術的核心蛋白，具有極大的工程改造和應用價值。獲得一種高活性的重組TET酶突變體，對于體外DNA甲基化技術的發展和在疾病診斷領域的應用，具有重要的價值。

本發明提供了增強TET酶活性的重組蛋白結構域，為DNA甲基化結合結構域（MBD），MBD1-4的氨基酸序列如SEQ?ID?1-4所示。通過MBD與TET酶融合形成的重組蛋白MBD-TET可以顯著增強TET酶包括NgTET1、mTET1CD、mTET2CDT、hTET1CD和hTET2CDT的氧化活性。此外，本發明還提供了適用于MBD-TET的反應緩沖液和簡便快速的高通量DNA甲基化檢測流程，能夠有效增強MBD-TET對5mC的氧化活性，提高基于TET酶氧化反應的DNA甲基化檢測技術的靈敏度和準確性。

發明內容

本發明的第一個目的是提供一種可增強TET酶活性的重組蛋白結構域。

所述的重組蛋白結構域是DNA甲基化結合結構域（MBD），MBD1-4氨基酸序列如SEQID?1-4所示，其中MBD1效果最優。

以及上述MBD的編碼DNA，其核苷酸序列如SEQ?ID?No.10-13中任一項所示。

本發明的第二個目的是提供一種增強TET酶，為在NgTET1、mTET1CD、mTET2CDT、hTET1CD或hTET2CDT的氨基端通過GGGS連接肽連接上述的重組蛋白結構域MBD1、MBD2、MBD3或MBD4，NgTET1、mTET1CD、mTET2CDT、hTET1CD、的hTET2CDT氨基酸序列分別如SEQ?ID?5-9所示，其中NgTET1最優。

本發明的又一目的是提供一種全基因組DNA甲基化檢測方法，其特征在于其步驟包括：

（1）采用上述的增強TET酶對模板DNA進行氧化；

（2）還原劑處理，堿中和；

（3）DNA回收；