[發明專利]一種特異性檢測非洲豬瘟病毒流行株和基因缺失株的LAMP引物組合及應用

在審

• 申請號: 202111530573.1
• 申請日: 2021-12-14
• 公開（公告）號: CN114015812A
• 公開（公告）日: 2022-02-08
• 發明（設計）人: 宋卉;李凡;牛曉玉;董翎;陳燕虹;邱昌偉;陸夢琪;李萍;余鵬
• 申請（專利權）人: 華中農業大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/6844;C12N15/11
• 代理公司: 武漢宇晨專利事務所(普通合伙) 42001
• 代理人: 龔瑩瑩

本發明屬于ASFV核酸檢測領域，公開了一種特異性檢測非洲豬瘟病毒流行株和基因缺失株的LAMP引物組合及應用。本發明所提供的LAMP引物可以很好的區分非洲豬瘟病毒流行株與基因缺失株，且具有靈敏度高、特異性好的特點，同時該方法中的保守基因B646L基因的引物可以檢測中國現階段流行的所有基因型的毒株，B646L基因、EP402R基因和MGF_360?14L基因的最低檢測限可達1 copies/μL。本方法簡單快速高效，一小時左右即可完成檢測。

技術領域

本發明屬于ASFV核酸檢測領域，具體涉及到一種特異性檢測非洲豬瘟病毒流行株和基因缺失株的LAMP引物組合及應用。

背景技術

非洲豬瘟(African swine fever，簡稱ASF)是一種由非洲豬瘟病毒(Africanswine fever virus，ASFV)引起的臨床表現為高熱、出血、呼吸困難、內臟器官廣泛性出血的高度接觸性傳染性疾病，主要在家豬和野豬之間傳播，也可通過軟蜱傳播，其特點是病程快、傳播廣、死亡率高。

2020年5月，中國農業科學院哈爾濱獸醫研究所報道了一株人工缺失基因的非洲豬瘟弱毒活疫苗對家豬具有良好的安全性和有效性。該研究團隊還證明，該疫苗完全具備大規模生產條件。該疫苗是目前最具實現產業化應用前景的疫苗，將為我國及有關國家非洲豬瘟疫情的有效防控提供重要技術手段。由于市面上對ASFV的檢測大多是對保守基因B646L進行檢測，加之該疫苗為弱毒活疫苗，因此該疫苗的使用會導致常規方法檢測結果為陽性，無法確定是接種了疫苗導致的陽性還是感染了野毒導致的陽性，因此需要對它們進行區分。

B646L基因(p72)是包括野生型和基因缺失型株在內的所有ASFV的保守區域，選擇該基因作為靶基因以區分ASFV與其他病毒。申請CN110551695A提供了一種非洲豬瘟病毒基因缺失弱毒株，該弱毒株是缺失以下基因的功能蛋白：CD2v基因編碼產物EP402R基因和三個多基因家族區段(MGF-360-12L、MGF-360-13L、MGF-360-14L)編碼產物；中國專利CN110093324B公開了一種基因II型的非洲豬瘟病毒MGF-360-505R缺失和CD2v與MGF-360-505R聯合缺失的基因缺失病毒。因此以B646L基因(p72)、MGF多基因家族區段(MGF-360-12L、MGF-360-13L、MGF-360-14L)和EP402R(CD2v)作為靶標，可以確定豬是感染了野生型ASFV還是基因缺失株。

關于非洲豬瘟病毒的檢測，國內外研究人員建立了多種核酸檢測方法，主要分為病原學檢測和血清學檢測。目前，已經報道的區分野生型和基因缺失型的檢測方法大多是熒光定量PCR，該方法靈敏度雖好但是探針的合成價格昂貴，而且需要使用專業的熒光定量PCR儀器進行檢測，各儀器之間性能差異大，實驗結果的分析需要專業的培訓。因此，本研究通過建立非洲豬瘟的環介導等溫檢測方法，研制出一種高效快速區分非洲豬瘟病毒流行株和基因缺失株的方法，解決基層豬場非洲豬瘟檢測成本高、操作復雜的問題。利用本發明提供的引物，比CN110885905A中公布的引物具有更強的靈敏性。