[發明專利]特異性分子靶標及其檢測金黃色葡萄球菌ST型的方法

在審

• 申請號: 202111520970.0
• 申請日: 2021-12-13
• 公開（公告）號: CN114196767A
• 公開（公告）日: 2022-03-18
• 發明（設計）人: 吳清平;周寶青;葉青華;王楚芳;代京莎;陳玲;張菊梅;丁郁;陳謀通;薛亮;王涓;吳詩;蔡淑珍;楊寧;陳惠元
• 申請（專利權）人: 廣東省科學院微生物研究所（廣東省微生物分析檢測中心）;廣東環凱生物科技有限公司
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/6851;C12Q1/686;C12N15/11;C12N1/20;C12R1/445
• 代理公司: 廣州三環專利商標代理有限公司 44202
• 代理人: 郝傳鑫;周全英

本發明涉及微生物檢驗技術領域，尤其是具體公開金黃色葡萄球菌ST型特異性分子靶標及其檢測金黃色葡萄球菌ST型的方法。本發明方法提供了用于鑒別3種金黃色葡萄球菌重要ST型的共6個新特異性分子檢測靶標、PCR引物組以及熒光定量PCR、多重PCR快速檢測方法。本發明的檢測方法有能力一步鑒別金黃色葡萄球菌ST7、ST188、ST398，大大提高了金黃色葡萄球菌MLST分型效率，增強了實用性；本發明的檢測方法還具有操作簡單、結果判定易、檢測時間短、特異性強、成本低的優點。

技術領域

本發明涉及微生物檢驗技術領域，尤其是涉及三種金黃色葡萄球菌ST型特異性分子靶標及其檢測金黃色葡萄球菌ST型的方法。

背景技術

金黃色葡萄球菌是重要的食源性致病菌之一，也是常見的醫院病原體之一。作為一種重要的人畜共患病原菌，金黃色葡萄球菌給人類健康、社會經濟建設造成重大危害。研究表明，每年由金黃色葡萄球菌引發的食物中毒事件占食源性微生物食物中毒事件的25％，其產生的毒素可導致嘔吐腹瀉、化膿性感染、血流感染、上呼吸道感染，甚至威脅人類生命健康。隨著抗生素廣泛應用于細菌治療，一系列耐藥性(如耐甲氧西林、卡那霉素、氯霉素等)金黃色葡萄球菌也不斷被發現，具有分布廣泛、流行廣泛、感染嚴重等特征，給臨床治療帶來巨大的挑戰。因此，建立精準的金黃色葡萄球菌溯源、流行性及危害分析平臺具有重要意義。1988年Maiden等建立了多位點測序分型(multilocus sequence typing，MLST)技術，通過測定多個管家基因中長度約為470bp核心片段的核苷酸序列，分析不同的菌株之間序列型的差異，從而揭示菌株間等位基因的多樣性，為全球流行病學數據標準化提供依據，廣泛應用于細菌的流行病學、致病性和進化學等研究。據報道，金黃色葡萄球菌ST398多數表現多重耐藥性，廣泛分布于在畜牧養殖場、社區、醫院等場所。研究人員對2010-2015年深圳地區臨床分離金黃色葡萄球菌進行MLST分型發現，耐紅霉素、四環素、妥布霉素的金黃色葡萄球菌主要型別為ST398、ST7、ST188及ST59等。根據本團隊前期對全國重點城市的零售食品、巴氏乳中病原微生物污染調研發現，金黃色葡萄球菌ST7、ST188及ST398是重要ST型別。因此，快速準確鑒別上述3種金黃色葡萄球菌重要的ST型，可為金黃色葡萄球菌污染調查、臨床監測、流行性及致病性研究提供依據。

根據SN/T 4525.2-2016《出口食品中致病菌的分子分型MLST方法第2部分：金黃色葡萄球菌》技術標準，金黃色葡萄球菌MLST分型方法主要包括：基因組DNA提取、多個管家基因選擇及擴增、擴增產物純化及測序分析、數據上傳分析及分型等，整個過程操作繁瑣、費時費力、成本也相對較高、不能滿足大批量、快速鑒定的需求。另一方面，隨著高通量測序技術的普及，通過獲取金黃色葡萄球菌的全基因組數據，并將數據上傳在線網站：https://pubmlst.org/databases/進行金黃色葡萄球菌MLST分型，該方法同樣可對金黃色葡萄球菌進行ST分型，但依舊存在檢測成本高、檢測周期長等缺點。隨著生物信息學及大數據庫分析的發展，基于泛基因分析的組學技術廣泛應用于細菌遺傳變異、基因功能富集和進化分析等研究。因此，基于泛基因組分析技術挖掘金黃色葡萄球菌ST型分子鑒定靶標具有很大的潛力。

特異性分子檢測靶標是保證PCR方法特異性、靈敏度的關鍵。目前，國內外PCR檢測方法一步鑒定金黃色葡萄球菌ST7、ST188、ST398的分子檢測靶標及引物相對較少，僅報道針對金黃色葡萄球菌ST398的分子靶標A07、C01和sau1-hsdS1，未有針對金黃色葡萄球菌ST7、ST188的分子檢測靶標，難以滿足實際快速檢測的需要。而且，隨著臨床治療過程中金黃色葡萄球菌新ST的不斷發現，基于原有的分子靶標的精準鑒定面臨了巨大的挑戰。尋找新型特異性靶標分子用于3種金黃色葡萄球菌重要ST型(ST7、ST188、ST398)快速、精確檢測具有重要意義。

發明內容

本發明的目的在于克服上述現有技術的不足之處而提供三種金黃色葡萄球菌ST型特異性分子靶標及其檢測金黃色葡萄球菌ST型的方法。通過本發明的特異性分子靶標和引物組，能夠精確的區分出金黃色葡萄球菌ST型，特異性較好，精確度較高。