[發明專利]一種高絲氨酸和蘇氨酸生物合成途徑的構建方法及應用

在審

• 申請號: 202111518422.4
• 申請日: 2021-12-13
• 公開（公告）號: CN114107408A
• 公開（公告）日: 2022-03-01
• 發明（設計）人: 董紅軍;李梁坡;周海川;謝永輝
• 申請（專利權）人: 中國科學院天津工業生物技術研究所
• 主分類號: C12P13/06
• 分類號: C12P13/06;C12P13/08;C12P7/24;C12P7/42;C12N9/04;C12N9/88;C12N9/10;C12N9/12;C12N1/21;C12N15/31;C12R1/19
• 代理公司: 北京知文通達知識產權代理事務所(普通合伙) 16051
• 代理人: 歐陽石文

本發明公開了一種高絲氨酸和蘇氨酸非天然生物合成新途徑的構建，屬于工業生物技術領域。所述非天然生物合成途徑中包含甲醇脫氫酶、醛縮酶、轉氨酶、高絲氨酸激酶、蘇氨酸合成酶，該途徑可以甲醇與丙酮酸為底物，合成高絲氨酸或蘇氨酸。既可以通過構建體外多酶催化體系，也可以通過在微生物細胞體內通過途徑組裝，實現以甲醇與丙酮酸為碳源合成高絲氨酸或蘇氨酸，而丙酮酸在微生物細胞體內可以葡萄糖為底物通過糖酵解合成，從而實現以甲醇與葡萄糖為碳源合成高絲氨酸或蘇氨酸。本發明將高能量密度的甲醇一碳化合物引入高絲氨酸和蘇氨酸合成途徑中，理論上可實現200%的糖酸摩爾轉化率，具有極大的應用前景。

技術領域

本發明涉及氨基酸工業生產技術領域，具體涉及高絲氨酸和蘇氨酸生物合成途徑的構建方法及應用，更具體以甲醇/甲醛和葡萄糖/丙酮酸為共底物成產高絲氨酸和蘇氨酸的方法，屬于工業生物經濟與制造領域。

背景技術

高絲氨酸和蘇氨酸是具有重要用途的氨基酸，主要用于醫藥、農藥前體、化學試劑、食品強化劑、飼料添加劑等方面。隨著氨基酸市場需求的不斷增加，行業競爭也日趨激烈。生產菌株是工業發酵的核心，各大蘇氨酸生產企業都在積極地提升菌株發酵性能，降低生產成本，以保持市場的競爭力。如何利用現代合成生物學理念，設計和構建新的高效生產菌株，申請專利獲得知識產權保護，將是現代氨基酸企業生存和發展的基本保障。

目前，高絲氨酸和蘇氨酸生產菌株主要是基于大腸桿菌構建的細菌細胞工廠，高絲氨酸和蘇氨酸的天然生物合成過程共利用一條途徑，而且高絲氨酸是蘇氨酸的前體。在大腸桿菌中，高絲氨酸和蘇氨酸天然合成途徑起始于糖酵解途徑的磷酸烯醇式丙酮酸，它經過羧化反應固定一個二氧化碳，成為草酰乙酸，然后再經過三步反應生成天冬氨酸半醛，天冬氨酸半醛繼而可以經過天冬氨酸激酶I、II（ThrA、MetL）參與的一步反應生成高絲氨酸，高絲氨酸則經過高絲氨酸激酶（ThrB）、蘇氨酸合成酶（ThrC）參與的兩步反應進一步生成蘇氨酸。現有的高絲氨酸和蘇氨酸工程菌株的構建就是基于這些天然生物合成途徑，進行了一系列的代謝工程改造，主要的策略包括：去除旁路途徑從而增強前體供應，增強氨基酸的轉運，解除代謝物對酶的反饋抑制/阻遏，以及動態調控生長與目標代謝物的時序關系等。

通過經典的代謝工程和基因表達的動態調控，高絲氨酸和蘇氨酸生物合成能力得到了很大的提升，然而我們也注意到，依賴于天然的生物合成途徑，其提升空間正在逐步靠近理論極限。根據代謝流和計量學分析,蘇氨酸天然途徑最大理論摩爾得率在100-133%之間（Systems?metabolic?engineering?of?Escherichia?coli?for?L-threonine?production.?Mol?Syst?Biol,?2007.?3:?149，），而在2020年發表的一篇文章中實際可達124%(?Rebalancing?microbial?carbon?distribution?for?L-threonine?maximization?using?a?thermal?switch?system.Metab?Eng,?2020.?61:?33-46，)。因此如何另辟蹊徑，實現超越天然生物合成途徑的理論極限，是未來氨基酸發酵行業的一個重要解決方案。

要實現這一目標，就必須打破原有的生物代謝途徑框架，引入新的底物原料和設計新的非天然合成路徑。蘇氨酸天然合成途徑的代謝特點在于：其天然途徑中二氧化碳的固定反應及其后的還原反應是一個高能耗和高還原力消耗的過程。一分子葡萄糖如果轉化成兩分子蘇氨酸，則額外需要四分子的NADPH和兩分子的ATP，因此最大理論摩爾得率在100-133%之間。如果能夠使用其它一碳原料替代低能的二氧化碳，那么就有可能減少對還原力和能量的需求，從而提高葡萄糖發酵生產蘇氨酸的得率，解決蘇氨酸微生物工業化生產的關鍵技術瓶頸問題。