[發(fā)明專利]一種新型的消化道腫瘤特異性LGR5核心啟動子及其篩選構建方法

在審

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• 申請日: 2021-12-10
• 公開（公告）號: CN114410626A
• 公開（公告）日: 2022-04-29
• 發(fā)明（設計）人: 王毅剛;黃芳;張蕾蕾;李強;周秀梅;黃飚;劉慧慧;張慧梨
• 申請（專利權）人: 浙江理工大學紹興生物醫(yī)藥研究院有限公司;浙江理工大學
• 主分類號: C12N15/113
• 分類號: C12N15/113;C12N15/85;C12N15/66
• 代理公司: 浙江納祺律師事務所 33257
• 代理人: 鄭滿玉

本發(fā)明公開的是一種新型的消化道腫瘤特異性LGR5核心啟動子及其篩選構建方法，啟動子為p312/?1786、p312/?1188、p312/?888、p312/?688、p312/?388、p312/?188中任一種，用PCR方法，以DNA基因組為模板，使用LGR5啟動子特異性引物，得到PCR產物為LGR5啟動子全長序列p312/?1786，用Nhe I和Hind III雙酶切，并且與pGL3?Basic質粒連接，得到pGL3?p312/?1786質粒；以pGL3?p312/?1786為模板，用攜帶Nhe I和Hind III酶切位點的不同的引物，經PCR獲得含有不同LGR5啟動子片段長度的質粒，并與pGL3?Basic質粒連接，分別得到對應的質粒，具有高效的消化道腫瘤特異性，易于掌握、提高了腺病毒載體的靶向性和安全性。

技術領域

本發(fā)明涉及一種核心啟動子及其篩選構建方法，更具體一點說，涉及一種新型的消化道腫瘤特異性LGR5核心啟動子及其篩選構建方法，屬于生物技術和基因治療領域。

背景技術

對于大多數種類的癌癥，目前仍然采用的是傳統(tǒng)療法如外科手術、放療、化療等，而面對很多中晚期惡性腫瘤，傳統(tǒng)療法顯得束手無策，主要表現在治愈率低、復發(fā)率及死亡率高、預后較差。基因治療是通過將外源正常基因導入靶細胞以糾正或補償因基因缺陷和異常引起的疾病，人們對腫瘤的基因治療寄寓極高的熱情，64.2％的基因治療臨床試驗均用于腫瘤治療。到目前為止，腫瘤的基因治療研究已取得了重要進展；對于惡性腫瘤，基因治療可利用腫瘤細胞與正常細胞間分子水平的差異，顯著拓寬腫瘤的“治療窗”，能高效地、選擇性地殺傷腫瘤細胞或阻止腫瘤細胞生長以及防止腫瘤的轉移。

2001年，中國科學院上海生物化學與細胞生物學研究所的劉新垣院士突破性的提出了癌癥的靶向基因-病毒治療(Cancer Targeting Gene-Viro Therapy)概念，綜合了基因治療和病毒治療兩者的優(yōu)勢，表現出良好的協(xié)同作用，大量的體內、外研究實驗表明靶向基因-病毒治療的效果要明顯優(yōu)于單獨的基因治療或者病毒治療的效果。其主要是以溶瘤腺病毒為載體，將目的基因插入到病毒基因組中，隨著病毒在腫瘤細胞中的不斷增殖，抗癌基因也隨之發(fā)生數百倍乃至千倍的復制，從而大量表達抗癌基因，克服了基因治療中，基因轉染效率低和基因拷貝數低的問題，也解決了病毒治療中殺傷力弱的問題，成為今后癌癥基因治療、病毒治療的新趨勢。

腺病毒載體具有許多獨特的優(yōu)點：腺病毒相對穩(wěn)定；安全性較好，在人類的腫瘤細胞中尚未發(fā)現有腺病毒的整合，未發(fā)現其與人類腫瘤的發(fā)生有直接關系；腺病毒基因組較大(36kb)，插入大片段外源性基因的潛力大；腺病毒的感染不依賴細胞周期，故其既可以感染增殖細胞也可以感染非增殖細胞；細胞及動物實驗表明，腺病毒載體容易將外源基因直接轉移到靶細胞中，并使其在細胞內有效表達成活性蛋白；腺病毒基因組較易操作。

利用腫瘤特異性啟動子控制病毒所攜帶的治療基因是構建腫瘤靶向性腺病毒的方法之一，其能使治療基因只能在腫瘤細胞內表達，而在正常細胞中不表達，從而大大降低了腫瘤基因治療的副反應而增強了其靶向性和療效。富含亮氨酸重復序列G蛋白偶聯(lián)受體5(leucine-rich repeat containing G protein coupled receptor 5,LGR5)是G蛋白偶聯(lián)受體超家族視紫紅質亞家族的成員。研究發(fā)現， LGR5在腫瘤的發(fā)生發(fā)展及腫瘤細胞的信號傳導過程中具有重要作用。近年研究表明，LGR5消化道腫瘤關系密切，包括肝癌、結腸癌和胰腺癌等，同時也與消化道腫瘤干細胞的干性維持密切相關，是消化道腫瘤的標志物，其異常表達能夠促進消化道腫瘤的發(fā)生發(fā)展，近年來針對該靶點的治療研究不斷增加，針對LGR5的新型治療方法對消化道腫瘤患者的個性化治療具有潛在的應用價值。