[發明專利]一種檢測沙門氏菌的多重液滴數字PCR試劑盒及其方法和應用

在審

• 申請號: 202111505493.0
• 申請日: 2021-12-10
• 公開（公告）號: CN114164286A
• 公開（公告）日: 2022-03-11
• 發明（設計）人: 史賢明;方正偉;周秀娟;詹澤強;崔妍
• 申請（專利權）人: 上海交通大學
• 主分類號: C12Q1/689
• 分類號: C12Q1/689;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/42
• 代理公司: 上海旭誠知識產權代理有限公司 31220
• 代理人: 鄭立

1.一種檢測沙門氏菌的多重液滴數字PCR試劑盒，其特征在于，所述試劑盒包含液滴數字PCR反應液和質控品，所述液滴數字PCR反應液中含有用于檢測沙門氏菌核酸的引物和探針，探針的兩端標記有熒光基團，引物和探針序列包括：

1)針對沙門氏菌STY1855核酸序列設計的正向引物序列如SEQ ID NO:1所示，反向引物序列如SEQ ID NO:2所示，所述探針序列如SEQ ID NO:7所示；

2)針對鼠傷寒沙門氏菌STM4495核酸序列設計的正向引物，序列如SEQ ID NO:3所示，反向引物序列如SEQ ID NO:4所示，所述探針序列如SEQ ID NO:8所示；

3)針對腸炎沙門氏菌SEN1392核酸序列設計的正向引物，序列如SEQ ID NO:5所示，反向引物序列如SEQ ID NO:6所示，所述探針序列如SEQ ID NO:9所示。

2.如權利要求1所述的檢測沙門氏菌的多重液滴數字PCR試劑盒，其特征在于，所述探針序列的5’端標記有熒光報告基團，3’標記有熒光淬滅基團，所述熒光報告基團光譜范圍不同。

3.如權利要求1所述的檢測沙門氏菌的多重液滴數字PCR試劑盒，其特征在于，

SEQ ID NO:7所示核苷酸序列的5’端標記有FAM，3’標記有Eclipse；

SEQ ID NO:8所示核苷酸序列的5’端標記有HEX，3’標記有BHQ1；

SEQ ID NO:9所示核苷酸序列的5’端標記有Cy5，3’標記有BHQ2。

4.根據權利要求1～3任一項所述的檢測沙門氏菌的多重液滴數字PCR試劑盒，其特征在于，所述液滴數字PCR反應液中包括5×PerfeCTa MultiPlex qPCR ToughMix、1μMFluorescein sodium salt、所述6種25μM正反向引物、所述3種25μM探針。

5.根據權利要求1所述的檢測沙門氏菌的多重液滴數字PCR試劑盒，其特征在于，質控品包括陰性質控品和陽性質控品，所述陰性質控品為無菌水，陽性質控品為沙門氏菌ATCC13076和ATCC 14028 DNA溶液。

6.一種利用權利要求1～5任一項所述多重液滴數字PCR試劑盒檢測沙門氏菌的方法，其特征在于，所述方法包括以下步驟：

步驟1、處理樣品：提取樣品DNA，得到樣品處理液；

步驟2、配制液滴數字PCR反應體系：將所述液滴數字PCR反應液與所述樣品處理液混合，得到液滴數字PCR反應混合液；

步驟3、液滴PCR擴增反應：將所述液滴數字PCR反應混合液加入數字PCR芯片中，置于液滴生成和擴增系統中生成液滴，然后進行PCR擴增反應；

步驟4、讀取熒光信號：將擴增后的數字PCR芯片置于熒光讀取儀中，利用軟件進行結果讀取和分析。

7.如權利要求6所述的多重液滴數字PCR試劑盒檢測沙門氏菌方法，其特征在于，所述步驟2中液滴數字PCR反應液與所述樣品處理液混合的體積比為11.5：1，樣品抽提總DNA的最佳實驗用量為10^-2-10^-3ng/μL。

8.如權利要求6所述的多重液滴數字PCR試劑盒檢測沙門氏菌方法，其特征在于，所述步驟2中液滴數字PCR反應混合液總體積為25μL，包括5×PerfeCTa MultiPlex qPCRToughMix 5μL、1μM Fluorescein sodium salt 2.5μL、6種25μM上下游引物各1μL、3種25μM探針各0.25μL、樣品DNA 2μL和無菌水8.75μL。

9.如權利要求6所述的多重液滴數字PCR試劑盒檢測沙門氏菌方法，其特征在于，所述步驟3中PCR擴增反應的條件為：95℃預變性10min；95℃30s、60℃30s，共進行45個循環。

10.權利要求1～9任一項所述的多重液滴數字PCR試劑盒檢測沙門氏菌方法在沙門氏菌及其兩種重要血清型檢測中的應用。