[發明專利]一種基于脫氧核酶的DNA納米步行機器的可控構建及其應用

在審

• 申請號: 202111502645.1
• 申請日: 2021-12-10
• 公開（公告）號: CN114525323A
• 公開（公告）日: 2022-05-24
• 發明（設計）人: 孟紅敏;王星;姜克梅;趙迪
• 申請（專利權）人: 鄭州大學
• 主分類號: C12Q1/6816
• 分類號: C12Q1/6816
• 代理公司: 暫無信息
• 代理人: 暫無信息

本方法涉及分子生物學技術領域，具體涉及利用Y型分支DNA組裝的一種比例可調的樹枝狀聚合物及其用于miRNA的檢測方法。該方法利用Y型分支DNA組裝了一種比例可調的樹枝狀聚合物，通過堿基的合理設計可以在其表面修飾上不同比例的脫氧核酶和底物鏈，在目標miRNA存在下，脫氧核酶被激活，然后切割同軌道上的底物鏈，熒光恢復。本發明利用由DNA構成的具有較高的生物相容性和穩定性納米結構，在進行細胞內目標物的檢測時能大大降低假陽性信號，并且實現了探針的精準可控組裝以獲得最佳的響應性能。

技術領域

本發明屬于分子生物學技術領域，涉及一種利用Y型分支DNA組裝而成的樹枝狀聚合物的可編程性、結構穩定、具有大小可調、多價性和對稱性可控構建以及脫氧核酶的特異性識別能力用于miRNA的檢測，具體涉及利用Y型分支DNA組裝的一種比例可調的樹枝狀聚合物及其用于miRNA的檢測方法。

背景技術

MicroRNA(miRNA)是一組內源性的非蛋白編碼的單鏈小分子RNA(19-25個核苷酸)，在調控基因表達過程中起關鍵作用。已有研究表明，miRNA參與多種生物學過程，包括增殖、代謝和凋亡。此外，miRNA的表達與許多疾病發生有關，如癌癥、糖尿病、心血管疾病和神經系統疾病。因此，它們作為預后和診斷的生物標志物而受到廣泛關注。然而，miRNA的低豐度和較高的序列相似性給量化它們帶來了很大的挑戰。

脫氧核酶作為一種催化型功能核酸，被廣泛應用到細胞內miRNA的檢測。比較常見的是使用金納米顆粒(AuNP)負載的脫氧核酶馬達在識別目標物后對同軌道上的熒光底物鏈進行行走切割。這種由脫氧核酶驅動的分子馬達在一定程度上有效加速了對目標物的檢測，但是基于Au-S鍵固定在AuNP表面的核酸鏈在進入細胞后，由于細胞內高濃度的硫醇類物質如谷胱甘肽的干擾，Au-S鍵非常容易被切斷，導致熒光鏈的脫落，從而出現假陽性信號。并且，將核酸修飾到AuNP表面時，由于微觀不可控，其表面修飾上的脫氧核酶與底物鏈的數量和比例難以精準控制，不利于實驗的進行。

近些年來，基于DNA納米結構構建的核酸載體逐漸受到研究者們的青睞，如四面體、三棱柱、納米線、Y型分支DNA等。其中，使用Y型分支DNA組裝而成的樹枝狀聚合物具有可編程性、可操作性、結構穩定及生物相容性好等特性，而且還具有大小可調、多價性和對稱性可控等優點，已逐漸成為一種具有發展前景的多功能的核酸載體。因此，基于脫氧核酶的DNA納米步行機器由于其較高的生物相容性和穩定性，在進行細胞內目標物的檢測時能大大降低假陽性信號，并且實現了探針的精準可控組裝以獲得最佳的響應性能。

發明內容

本發明為解決常見的金納米顆粒負載的脫氧核酶驅動的分子馬達由于細胞內高濃度的硫醇類物質如GSH干擾，導致假陽性信號以及核酸修飾到AuNP表面的微觀不可控性，提出一種基于脫氧核酶的DNA納米步行機器的可控構建及其用于miRNA的檢測方法。這樣由DNA 構成的納米結構由于其較高的生物相容性和穩定性，在進行細胞內目標物的檢測時能大大降低假陽性信號，并且實現了探針的精準可控組裝以獲得最佳的響應性能。

實現本發明的技術方案是：一種基于脫氧核酶的DNA納米步行機器的構建，步驟如下：

一種Y型分支DNA納米步行機器，其特征在于：所述DNA納米步行機器由Y型DNA、封閉的脫氧核酶和酶切底物分步組裝所得；粒徑約為45nm。Y型分支DNA納米步行機器對miRNA-21的檢測限為23pM。

所述的Y型分支DNA納米步行機器的制備方法，步驟如下：

(1)將等摩爾的Y0a、Y0b、Y0c加到Tris-HCl緩沖液中混勻后在95℃水浴中加熱5min后緩慢冷卻至室溫得到Y0，然后使用相同方法進行Y1(Y1a、Y1b、Y1c)和Y2(Y2a、 Y2b、Y2c)的制備；將一條Dz-7脫氧核酶和一條封閉住其一端結合臂的封鎖鏈(locker)一起混合溶于Tris-HCl緩沖液中，在95℃水浴中加熱5min后取出置于冰上再孵育15min，即可得到雙鏈結構的D-L；