[發明專利]一種無需提取RNA的馬鈴薯病毒一步三重定性檢測方法

在審

• 申請號: 202111500599.1
• 申請日: 2021-12-09
• 公開（公告）號: CN114015811A
• 公開（公告）日: 2022-02-08
• 發明（設計）人: 李經緯;張萬萍;徐秀紅;裴蕓;何敏;陸錦彪
• 申請（專利權）人: 貴州大學
• 主分類號: C12Q1/70
• 分類號: C12Q1/70;C12Q1/686;C12N15/11;C12R1/94
• 代理公司: 貴陽中工知識產權代理事務所 52106
• 代理人: 王蕊

本發明公開了一種無需提取RNA的馬鈴薯病毒一步三重定性檢測方法，包括以下步驟：以有感染病毒癥狀，但不知其具體病毒的“紫花白”馬鈴薯試管苗作為樣品，配置三重One?step RT?PCR反應體系；進行PCR反應；瓊脂糖凝膠電泳檢測；判斷檢測結果。本發明建立了基于微量取樣法和一步逆轉錄鏈式聚合反應的三重病毒基因檢測方法，該方法中引物定性檢測準確率100%，檢測結果根據取樣部位假陰性率0.5%，假陽性率0%。本發明的有益效果在于：顯著簡化RT?PCR中RNA提取、純化及逆轉錄等步驟，一次PCR操作可同時檢測3種馬鈴薯病毒，顯著節省病毒檢測的成本和時間。

技術領域

本發明涉及病毒檢測技術領域，具體涉及一種無需提取RNA的馬鈴薯病毒三重One-step RT-PCR定性檢測方法。

背景技術

馬鈴薯是以無性繁殖為主的作物，很容易感染病毒，當病毒侵入馬鈴薯體內以后，主要通過改變馬鈴薯細胞的代謝途徑，使馬鈴薯正常的生理機能受到干擾和破壞，導致馬鈴薯發生病毒病，從而影響馬鈴薯的產量和品質。同時多種病毒可復合感染，加重了危害程度。病毒病可由薯塊傳播并世代累積，從而導致種薯退化，商品薯降低甚至絕產，造成嚴重的經濟損失。

目前常用馬鈴薯病毒檢測的方法，主要包括寄主生物學檢測法、抗血清檢測法、電子顯微鏡檢測法、酶聯免疫檢測法和分子生物學檢測法。反轉錄聚合酶鏈式反應（RT-PCR）檢測法屬于分子生物學檢測法，需要耗費大約7個小時。

RT-PCR、一步法 RT-PCR 檢測技術、二重 RT-PCR 快速檢測法、三重RT-PCR 快速檢法、多重 RT-PCR 技術均需要提取RNA的步驟，不能節約RNA提取、純化以及逆轉錄操作的成本和時間。

發明內容

本發明要解決的技術問題是針對上述不足提供一種快速檢測馬鈴薯3種病毒的方法，同時檢測結果的可靠性。

為實現上述目的，本發明提供了一種無需提取RNA的馬鈴薯病毒一步三重定性檢測方法，包括以下步驟：

（1） 按照PrimeScrip One Step RT- PCR Kit Ver.2（Takara）說明書配置RT-PCR反應體系，加入PLRV、PVY和PVS 等3對引物；所述3對引物序列為：PLRV-F:5’-ATGAGTACGGTCGTGGTTAA-3’、

PLRV-R: 5’-CTATTTGGGGTTTTGCAAAG-3’；PVY-F:5’-GGCATACGGACATAGGAGAAACT-3’、

PVY-R:5’-CTCTCTGTGTTCTCCTCTTGTGT-3’；

PVS-F:5’-ACCRGATCCGACAAGCTCAGG-3’、

PVS-R: 5’-GCCATTTGCTCRGTGTTGG-3’；

（2）以有感染病毒癥狀，但不知其具體病毒的‘紫花白’馬鈴薯試管苗作為實驗材料，取莖段，縱切，暴露維管束；

（3）利用無菌針頭插入維管束中，取粘在針頭上的微量汁液；

（4）帶汁液的針頭插入步驟（1）中配置的RT-PCR反應體系，反復攪勻，取出針頭；

（5）50℃反應30 min；

（6）病毒基因片段PCR擴增；

（7）利用瓊脂糖凝膠電泳讀帶，判斷檢測結果。

結果判斷：與陽性對照條帶一致為陽性，陽性材料無帶為假陰性，與陰性對照一致無條帶為陰性，陰性對照有條帶為假陽性。

上述方法中：無需提取RNA。

本發明的優點在于：

（1）顯著減少RNA病毒常規RT-PCR檢測中RNA提取、純化以及逆轉錄操作的成本和時間。

（2）檢測靈敏度高，引物檢測有效率100%， 假陰性率根據取樣部位為0.5%，假陰性率0%。

附圖說明