[發(fā)明專利]一種小鼠肺微血管內皮細胞永生化以獲得胞外囊泡的方法

在審

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• 申請日: 2021-12-09
• 公開（公告）號: CN114149977A
• 公開（公告）日: 2022-03-08
• 發(fā)明（設計）人: 邱海波;劉旭;夏飛萍;郭鳳梅;劉玲
• 申請（專利權）人: 東南大學
• 主分類號: C12N5/10
• 分類號: C12N5/10;C12N5/071;C12N15/867
• 代理公司: 北京同輝知識產權代理事務所(普通合伙) 11357
• 代理人: 趙丹

本發(fā)明公開一種小鼠肺微血管內皮細胞永生化以獲得胞外囊泡的方法，包括以下步驟：S1、小鼠肺微血管內皮原代細胞分離：分離新生小鼠邊緣肺組織，用眼科剪刀將組織剪成小塊，制備單細胞懸液，磁珠陰性選擇去除CD45⁺、CD90.2⁺和CD326⁺的細胞，篩選內皮細胞集落進行體外增殖；S2、內皮細胞永生化：轉染六種慢病毒并進行篩選，根據(jù)細胞的生長速率和形態(tài)選擇永生化細胞株；S3、囊泡提取：采用超聲離心法提取囊泡。本發(fā)明通過磁珠陰性選擇和圈選手段，避免了傳統(tǒng)磁珠陽性選擇提取細胞的損害，極大改善內皮細胞的損耗；本發(fā)明通過轉染慢病毒至原代細胞，構建永生化細胞，永生化細胞分泌囊泡保留了原代細胞分泌囊泡的特性，極大降低囊泡提取成本。

技術領域

本發(fā)明涉及細胞培養(yǎng)技術領域，具體是一種小鼠肺微血管內皮細胞永生化以獲得胞外囊泡的方法。

背景技術

肺微血管內皮細胞(PMECs)是肺泡毛細血管屏障的重要組成部分，參與氣體交換。它們在肺內穩(wěn)態(tài)和炎癥反應中發(fā)揮重要作用。鑒于PMECs的重要作用，體外培養(yǎng)PMECs對于闡明肺部疾病的分子和細胞機制至關重要。小鼠肺微血管內皮細胞(pMPMECs)的研究受到細胞培養(yǎng)的限制。目前已經(jīng)發(fā)表的分離pMPMECs最常見的方法包括：肺組織的酶解和pMPMECs對CD31或CD102磁珠免疫結合法。但是，pMPMECs的陽性磁珠選擇會導致細胞早期衰老，增殖能力低。此外，磁珠的非特異性結合通常會導致肺組織中其他細胞(如成纖維細胞、平滑肌細胞、上皮細胞)的污染。

PMECs分泌的細胞外囊泡(PMEC-EVs)直接分泌到血流中，并能與循環(huán)白細胞相互作用，調節(jié)局部免疫反應。越來越多的研究表明，PMEC-EVs與炎癥性肺部疾病的病理生理有關，而PMEC-EVs介導肺部疾病的具體作用機制研究尚處于探索階段。由于pMPMECs分泌EV的能力有限，且缺乏可靠的pMPMECs細胞系。許多研究者在研究中使用臍靜脈內皮細胞來源的囊泡而不是PMEC-EVs。然而，囊泡具有高度的異質性，不同來源的囊泡特性差異很大。因此，使用其他內皮細胞來源的囊泡來探索PMECs-EVs在肺部疾病中的作用可能會導致研究偏倚。

發(fā)明內容

本發(fā)明的目的在于提供一種小鼠肺微血管內皮細胞永生化以獲得胞外囊泡的方法，解決了上述技術問題，避免了傳統(tǒng)磁珠陽性選擇提取細胞的損害，極大改善內皮細胞的損耗和細胞老化問題；通過轉染慢病毒至原代細胞，構建永生化細胞，永生化細胞分泌囊泡保留了原代細胞分泌囊泡的特性，極大降低囊泡提取效率和成本。

本發(fā)明的目的可以通過以下技術方案實現(xiàn)：

一種小鼠肺微血管內皮細胞永生化以獲得胞外囊泡的方法，包括以下步驟：

S1、小鼠肺微血管內皮原代細胞分離

1)小鼠肺緣單細胞懸液的制備

分離小鼠肺組織，組織碎化并制備單細胞懸液；

2)小鼠肺緣單細胞培養(yǎng)

將單細胞懸液加入完全培養(yǎng)基培養(yǎng)至細胞融合度90％以上；

3)小鼠肺微血管內皮細胞的分離純化

對重懸后的單細胞進行陰性選擇：利用抗小鼠CD45磁珠、抗小鼠CD90.2磁珠和抗小鼠CD326磁珠分別去除淋巴細胞、成纖維細胞和上皮細胞；

S2、內皮細胞永生化

S2.1將500ul小鼠肺微血管內皮原代細胞懸液種于膠原包被的24孔板中(3×10⁴個細胞/孔)，培養(yǎng)24h。