[發明專利]弓形蟲核酮糖-5-磷酸異構酶TgRPI基因編輯蟲株及其應用

有效

• 申請號: 202111495124.8
• 申請日: 2021-12-08
• 公開（公告）號: CN114164114B
• 公開（公告）日: 2022-12-13
• 發明（設計）人: 馮耀宇;夏寧波;郭雪芳;肖立華;李娜;郭亞瓊;元冬娟
• 申請（專利權）人: 華南農業大學;嶺南現代農業科學與技術廣東省實驗室
• 主分類號: C12N1/11
• 分類號: C12N1/11;C12N15/79;A61K39/002;A61P33/02;C12R1/90
• 代理公司: 武漢智嘉聯合知識產權代理事務所(普通合伙) 42231
• 代理人: 徐紹新

弓形蟲核酮糖?5?磷酸異構酶TgRPI基因編輯蟲株及其應用。本發明公開了一個有潛力的疫苗和藥物設計靶點和一種預防弓形蟲感染的基因敲除蟲株。所述疫苗和藥物設計靶點為弓形蟲核酮糖?5?磷酸異構酶TgRPI基因，其核苷酸序列如SEQ ID NO：2所示。所述基因敲除蟲株敲除了TgRPI基因，該基因敲除蟲株在體外生長速度減緩，但是可以傳代培養，在動物體內具有毒力小、繁殖少等特性，能提高動物對弓形蟲的免疫能力。由于TgRPI對弓形蟲體內外生長有重要作用，故有成為疫苗和藥物靶點的潛力，且該基因敲除蟲株有成為抗弓形蟲基因工程疫苗的潛力。

技術領域

本發明屬于基因工程領域，尤其涉及一種預防弓形蟲感染的基因缺失疫苗、制備方法及其應用。

背景技術

弓形蟲是從屬于頂復門的一種專性細胞內寄生原蟲，能夠感染包括人在內的幾乎所有溫血動物，入侵所有的有核細胞，是非常重要的人畜共患病原體。弓形蟲感染孕婦或者孕畜可導致流產、產死胎或畸形胎等；感染艾滋病和器官移植患者等免疫力低下或受損的人群可導致急性呼吸衰竭、局限性肺炎、視網膜脈絡叢炎等，嚴重時可以致死。盡管弓形蟲病防治需求迫切，但是目前尚無理想的藥物或者疫苗，因此，篩選潛在的疫苗和藥物設計靶點、研制候選的弓形蟲疫苗顯得至關重要。

高溫滅活弓形蟲速殖子或提取弓形蟲可溶性、分泌性天然蛋白，免疫接種動物，不能引起免疫保護或者免疫保護效果非常有限。構建重組蛋白或基于載體的亞單位疫苗，雖能在一定程度延長動物的存活時間，但是仍不能提供足夠的免疫保護力，保護效果不理想。

構建良好的減毒或弱毒活疫苗被認為是預防弓形蟲病最有希望的策略。當前市場上唯一的商品化弓形蟲疫苗是通過在實驗室傳統傳代致弱獲得的，其僅在綿羊中使用且存在毒力返強的風險，并不適用于我國畜牧養殖業。盡管利用遺傳學的手段進行了弓形蟲減毒蟲株的構建，但是，目前具備潛力的弓形蟲減毒候選活疫苗數量仍非常有限，仍需篩選更多潛在的疫苗設計靶點，研制更多候選的弓形蟲疫苗蟲株。

蟲體中重要的代謝途徑可以成為潛在的藥物和疫苗設計靶點。磷酸戊糖途徑(PPP)是葡萄糖代謝的重要途徑，產生核酮糖-5-磷酸、果糖-6-磷酸(F6P)、核糖-5-磷酸(R5P)和還原型輔酶Ⅱ(NADPH)等中間產物，與糖酵解、氨基酸和脂肪酸等代謝途徑形成碳代謝網絡。弓形蟲PPP途徑非氧化反應階段核酮糖-5-磷酸異構酶(TgRPI)催化核酮糖-5-磷酸(Ru5P)生成核糖-5-磷酸(R5P)，而R5P是核苷酸代謝的重要底物。本發明聚焦TgRPI在弓形蟲體外生長、體內繁殖與毒力的作用。我們利用CRISPR/Cas9遺傳改造技術構建了TgRPI敲除蟲株，該蟲株在體外可以傳代培養，但是缺失TgRPI基因減緩蟲體體外生長，并顯著降低體內繁殖，降低體內毒力，表明：弓形蟲TgRPI是一個有潛力的疫苗和藥物設計靶點。TgRPI敲除蟲株具有良好免疫原性和免疫保護力，其是減毒弓形蟲候選疫苗蟲株，其應用對于人類健康和畜牧養殖業的健康發展均具有重要價值和意義。

發明內容

針對弓形蟲病目前尚無理想的藥物或者疫苗，本發明的目的在于提供一種弓形蟲基因編輯蟲株及其構建方法和應用。

為實現上述發明目的，本發明提供了一種弓形蟲基因編輯蟲株，該蟲株缺失核苷酸序列如SEQ ID No.2所示的弓形蟲核酮糖-5-磷酸異構酶TgRPI基因，接著分析了敲除蟲株的特性，并研究了敲除蟲株的應用，具體內容如下：

(1)空斑實驗結果表明：缺失TgRPI基因減緩蟲體體外生長。

(2)荷蟲量實驗結果表明：缺失TgRPI基因顯著降低體內繁殖。

(3)毒力試驗結果表明：敲除TgRPI基因顯著降低蟲體對小鼠的毒力。

(4)免疫保護力試驗結果表明：免疫接種TgRPI基因敲除蟲株對小鼠抵抗野生型蟲株感染具有良好的保護力，有成為基因工程疫苗的潛力。

本發明進一步提供了一種所述弓形蟲基因編輯蟲株的構建方法，該方法包括以下步驟：