[發(fā)明專利]用于檢測(cè)堿性磷酸酶的單分子熒光生物傳感器及其方法

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• 申請(qǐng)?zhí)枺?/td>: 202111492541.7
• 申請(qǐng)日: 2021-12-08
• 公開(kāi)（公告）號(hào): CN114517225A
• 公開(kāi)（公告）日: 2022-05-20
• 發(fā)明（設(shè)計(jì)）人: 張春陽(yáng);馬飛;趙寧寧
• 申請(qǐng)（專利權(quán)）人: 山東師范大學(xué)
• 主分類(lèi)號(hào): C12Q1/6825
• 分類(lèi)號(hào): C12Q1/6825;C12Q1/42
• 代理公司: 濟(jì)南圣達(dá)知識(shí)產(chǎn)權(quán)代理有限公司 37221
• 代理人: 張曉鵬

1.一種用于檢測(cè)堿性磷酸酶的單分子熒光生物傳感器，其特征在于，所述單分子熒光生物傳感器包括：?jiǎn)捂淒NA、發(fā)夾探針1(HP1)、發(fā)夾探針2(HP2)、鏈霉親和素偶聯(lián)磁珠、氫氧化鈉溶液；其中，單鏈DNA為在3'端標(biāo)記生物素的5'磷酸化的單鏈DNA；發(fā)夾探針1(HP1)和發(fā)夾探針2(HP2)為Cy5標(biāo)記的發(fā)夾探針；單鏈DNA和發(fā)夾探針1(HP1)和發(fā)夾探針2(HP2)通過(guò)鏈置換反應(yīng)形成探針·HP1·HP2三重鏈。

2.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單分子熒光生物傳感器，其特征在于，所述單鏈DNA從5'端到3'端的序列為：P-AGT CTA GGA TTC GGC GTG GGT TAA TTT TTT-Biotin。

3.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單分子熒光生物傳感器，其特征在于，發(fā)夾探針1(HP1)從5'端到3'端的序列為：TTA ACC CAC GCC GAA TCC TAG ACT CAA AGT AGT CTA GGA TTC GGCGTG-Cy5；

發(fā)夾探針2(HP2)從5'端到3'端的序列為：AGT CTA GGA TTC GGC GTG GGT TAA CACGCC GAA TCC TAG ACT ACT TTG-Cy5。

4.根據(jù)權(quán)利要求1所述的單分子熒光生物傳感器，其特征在于，所述氫氧化鈉溶液濃度為1.5-2mol/L，優(yōu)選1mol/L；單分子熒光生物傳感器包括λexo酶。

5.一種利用如上述權(quán)利要求任一項(xiàng)所述的單分子熒光生物傳感器的堿性磷酸酶檢測(cè)方法，其特征在于，包括如下步驟：

(1)將含堿性磷酸酶的待測(cè)物、在3'端標(biāo)記生物素的5'磷酸化的單鏈DNA和緩沖液混合，在適當(dāng)溫度下進(jìn)行孵育；(2)然后加入λexo酶在適當(dāng)溫度下反應(yīng)；(3)將反應(yīng)得到的消化產(chǎn)物加入到含有雜交緩沖液、HP1和HP2的溶液中，在適當(dāng)溫度下反應(yīng)；(4)隨后加入鏈霉親和素偶聯(lián)磁珠捕獲雜交產(chǎn)物，并通過(guò)磁分離去除未反應(yīng)的HP1和HP2；(5)用反應(yīng)緩沖液洗滌后，加入NaOH溶液孵育，誘導(dǎo)DNA鏈解體，得到含有游離HP1和HP2的上清液，用于進(jìn)一步測(cè)定。

6.根據(jù)權(quán)利要求5所述的堿性磷酸酶檢測(cè)方法，其特征在于，所述步驟(1)中，在3'端標(biāo)記生物素的5'磷酸化的單鏈DNA的濃度為200-300納摩爾每升，優(yōu)選250納摩爾每升；緩沖液為10×CutSmart緩沖液；在37℃下孵育30-50分鐘，優(yōu)選40分鐘。

7.根據(jù)權(quán)利要求5所述的堿性磷酸酶檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(2)中，λexo酶的用量為3-5U，優(yōu)選4U；在37℃下反應(yīng)20-40分鐘，優(yōu)選30分鐘。

8.根據(jù)權(quán)利要求5所述的堿性磷酸酶檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(3)中，雜交緩沖液由50毫摩爾每升Na₂HPO₄和0.5摩爾每升NaCl組成，其pH為6.8；HP1和HP2濃度為400納摩爾每升；在37℃下反應(yīng)0.5-2小時(shí)，優(yōu)選1小時(shí)。

9.根據(jù)權(quán)利要求5所述的堿性磷酸酶檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(4)中，鏈霉親和素包覆的磁珠的用量為4-6微升，優(yōu)選5微升。

10.根據(jù)權(quán)利要求5所述的堿性磷酸酶檢測(cè)方法，其特征在于，步驟(5)中，加入含1摩爾每升NaOH的蒸餾水50微升，反應(yīng)5分鐘，誘導(dǎo)DNA鏈解體。