[發明專利]一種在人血清白蛋白內部融合多肽的方法

在審

• 申請號: 202111492441.4
• 申請日: 2021-12-08
• 公開（公告）號: CN114133458A
• 公開（公告）日: 2022-03-04
• 發明（設計）人: 黃明東;袁彩;黃志偉;林華建;江龍光;徐芃;藺海莉
• 申請（專利權）人: 福州大學
• 主分類號: C07K19/00
• 分類號: C07K19/00;C12N9/72
• 代理公司: 福州元創專利商標代理有限公司 35100
• 代理人: 彭琴;蔡學俊

本發明公開一種在人血清白蛋白內部融合多肽的方法。本發明所述方法是以HSA的晶體結構為基礎，選擇在HSA的兩個轉彎C168?C177與C360?C369上，通過基因融合插入具有生物活性的多肽；所選擇的兩個轉彎位于HSA三級結構表面且向外凸，結構緊湊，因此該方法不影響HSA的二級結構及藥物結合能力，而且能夠維持多肽的高生物活性。在生物工程制藥業及基因工程、生物化學、分子生物學等研究領域具有重要應用價值。

技術領域

本發明屬于生物醫藥技術領域，具體涉及一種在人血清白蛋白內部融合多肽的方法。

背景技術

人血清白蛋白 (human serum albumin, HSA) 是血漿的主要成分，在血漿中的濃度為35 ~ 50 mg/ml。HSA由 585 個氨基酸組成，其相對分子質量約為 66.5kDa，正常情況下不易透過腎小球，故半衰期長達19天。HSA既可以通過化學結合也可以通過基因融合有效延長目的蛋白或多肽的半衰期，是一種理想的生物活性蛋白或多肽的載體。

HSA融合技術是指利用基因工程技術，將目的蛋白基因與 HSA 基因融合后，選擇合適的系統進行表達，最終獲得半衰期更長的藥物，已經發展成為蛋白質藥物長效化改造的一個通用技術，近年來在長效干擾素、粒細胞生長因子以及白介素等藥物的研制上得到了廣泛的應用。通常，多肽都是融合在HSA的N端或C端，然而，這種首尾相連的融合方式往往會降低多肽的活性。據報道，將胰高血糖素樣肽-1受體 (GLP-1R)的一個多肽激動劑AGLP-1融合在HSA的N端有效延長了其半衰期，然而相比于AGLP-1，融合蛋白與GLP-1R的結合能力降低了100倍。同樣地，生長抑素-14 (somatostatin-14, SST-14)對所有生長抑素受體亞型(somatostatin receptor subtypes, SSTRS)都具有高親和活性。然而，將兩段重復的SST-14融合在HSA的N端，所得到的融合蛋白(SST14)₂-HSA對所有受體亞型的親和活性都降低了。相比于SST-14，(SST14)₂-HSA 對5種SSTR的親和力都表現出不同程度的下降。

因此，為了維持多肽的高生物活性，構建多肽與HSA的融合蛋白時，合適的融合位點非常重要。

發明內容

本發明的目的在于針對上述問題，提供一種在人血清白蛋白（HSA）內部融合多肽的方法。該方法基于HSA的晶體結構，找到新的適合融合多肽的位點，即兩段位于HSA三級結構表面的兩個轉彎 (C168-C177與C360-C369) 上，提供一種在HSA內部融合多肽且維持多肽高活性的融合方法。

為實現上述目的，本發明采用如下技術方案：

一種在人血清白蛋白（HSA）內部融合多肽的方法：將具有生物活性的多肽融合在人血清白蛋白(human serum albumin, HSA)結構域Ⅰ和Ⅱ的兩條α螺旋鏈之間兩段轉彎C168-C177與C360-C369 位點上。

上述兩段轉彎 C168-C177與C360-C369 位點，附近存在兩對二硫鍵 C168-C177和C169-C124 ； C360-C369和C361-C316；結構緊湊，有利于維持多肽的活性構象；且該兩段轉彎位于HSA表面并向外凸出，有利于消除HSA與多肽之間以及融合蛋白與靶向受體之間的空間位阻；該兩段轉彎遠離HSA與新生兒Fc受體(FcRn)的結合位點，有利于保持HSA長達19天半衰期的特性，改善融合多肽的藥代動力學性質。

上述具有生物活性的多肽包括但不限于：氨基酸序列為CVSNKYFSNIHWC多肽；或氨基酸序列為CPAYSRYIGC的多肽。

一種在人血清白蛋白（HSA）內部融合多肽的方法，包括以下步驟：

（1）內部融合位點選擇：內部融合位點選擇位于HSA結構域Ⅰ和Ⅱ的兩條α螺旋鏈之間兩段轉彎C168-C177與C360-C369上；