[發明專利]一種從動物組織中提取AAV DNA的方法

在審

• 申請號: 202111489560.4
• 申請日: 2021-12-08
• 公開（公告）號: CN114250222A
• 公開（公告）日: 2022-03-29
• 發明（設計）人: 大明;蔡中山;孔令潔;隋禮麗
• 申請（專利權）人: 蘇州博騰生物制藥有限公司
• 主分類號: C12N15/10
• 分類號: C12N15/10
• 代理公司: 蘇州新知行知識產權代理事務所(特殊普通合伙) 32414
• 代理人: 鄭麗玲

1.一種從動物組織中提取AAV DNA的方法，其特征在于：其包括以下步驟：

S1、配制所需的溶液，溶液1包含有Tris-HCl和EDTA，pH值為 7.5；溶液2包含有SDS水溶液；溶液3包含有CsCl、K-乙酸和乙酸；溶液4包含有NaCl、Tris-HCl和乙醇，pH值為 7.5；溶液5為RNase A 溶液；溶液6為蛋白酶 K 溶液；

S2、從所選動物的整個器官中獲取組織樣本，將組織樣本轉移到潔凈的研缽中，將組織樣本切碎成小塊，然后用研杵勻漿直至糊狀物變稠；

S3、從步驟S2處理后的樣本中取適量轉移到容器管中，向容器管內添加適量的溶液1；

S4、向步驟S3所述的容器管中加入適量的溶液2，然后加入適量的溶液6，在50-60℃下振蕩孵育2-6小時，使樣本細胞裂解完成；

S5、將S4裂解完成的樣本細胞溶液冷卻至室溫，向其中添加適量的溶液5，混合均勻，并在室溫下孵育30分鐘以上；

S6、向步驟S5所述的溶液中加入適量的溶液3，立即輕輕混合并置于冰上降溫30分鐘以上；

S7、在4℃下以5000g離心15-30分鐘，通過紗布對溶液進行過濾，將上清液轉移到新的容器管中，再通過真空過濾器對上清液進行過濾；

S8、向步驟S7中用真空過濾器過濾后的上清液中加入1倍體積的乙醇，通過沉淀大部分DNA來防止目標AAV DNA的損失；

S9、將步驟S8處理后的溶液加載到回收柱中，用溶液4洗滌回收柱若干次，然后以最大速度離心3-10分鐘以去除回收柱內殘留的洗滌緩沖液；

S10、用適當體積的水對回收柱洗脫若干次，從洗脫得到的洗脫溶液中取適量的洗脫溶液轉移至新的容器管中，渦旋3-10秒，通過小直徑移液器吸頭吹打以剪切洗脫溶液中的染色體DNA；

S11、向步驟S10處理后的溶液中添加適量的10X的核酸外切酶V緩沖液；

S12、向步驟S11處理后的溶液中添加適量的ATP溶液；

S13、添加適量的核酸外切酶V，去除宿主DNA和非附加型病毒DNA，然后添加適量的溶液5，用封口膜密封，并在37℃下孵育過夜；

S14、使用基于微型柱的DNA純化試劑盒進行純化，用溫洗脫緩沖液雙重洗脫，獲得純化的AAV DNA；

S15、以PCR反應體積的5%的純化的AAV DNA用作PCR模板，進行PCR擴增檢測。

2.根據權利要求1所述的從動物組織中提取AAV DNA的方法，其特征在于：步驟S2中，用研杵勻漿直至糊狀物變稠時，加入適量的溶液 1。

3.根據權利要求1所述的從動物組織中提取AAV DNA的方法，其特征在于：步驟S3中，步驟S2處理后的樣品取適量轉移到容器管中，剩余樣品在-80℃下儲存。

4.根據權利要求1所述的從動物組織中提取AAV DNA的方法，其特征在于：步驟S7中，通過紗布對溶液過濾后，使用移液管將上清液轉移到新的容器管中，避免轉移的上清液中含有漂浮物。

5.根據權利要求1所述的從動物組織中提取AAV DNA的方法，其特征在于：步驟S9中，所述的回收柱為Zymo-spin VI 離心柱或其他具有 500 μg DNA 結合能力的硅膠柱。

6.根據權利要求1所述的從動物組織中提取AAV DNA的方法，其特征在于：步驟S9中，使用真空機或離心機將步驟S8處理后的溶液加載到回收柱中。

7.根據權利要求1所述的從動物組織中提取AAV DNA的方法，其特征在于：所述溶液4洗滌緩沖液為包含有NaCl、Tris-HCl pH 7.5和80% 乙醇的溶液。

8.根據權利要求1所述的從動物組織中提取AAV DNA的方法，其特征在于：所述溶液5的RNase A 溶液是將 RNase A 溶解在 Tris-HCl pH 7.5、NaCl 溶液中，然后在沸水浴中放置5-15分鐘，冷卻至室溫得到的RNase A 溶液。