[發(fā)明專利]USP30基因作為靶點在抑制塞內(nèi)卡谷病毒復(fù)制中的應(yīng)用

有效

• 申請?zhí)枺?/td>: 202111489506.X
• 申請日: 2021-12-07
• 公開（公告）號: CN114134211B
• 公開（公告）日: 2022-08-23
• 發(fā)明（設(shè)計）人: 鄭海學(xué);朱紫祥;趙振翔;齊曉蘭;楊帆;曹偉軍;張向樂;陳淑瑩;劉湘濤
• 申請（專利權(quán)）人: 中國農(nóng)業(yè)科學(xué)院蘭州獸醫(yī)研究所
• 主分類號: C12Q1/6851
• 分類號: C12Q1/6851;G01N33/573;C12N15/113;C12N15/85;C12N5/10;C12N15/55;A61K45/00;A61K31/713;A61K31/7088;A61K48/00;A61P31/14
• 代理公司: 北京力量專利代理事務(wù)所(特殊普通合伙) 11504
• 代理人: 毛婷

本發(fā)明屬于基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及USP30基因作為靶點在抑制塞內(nèi)卡谷病毒復(fù)制中的應(yīng)用。(1)本發(fā)明發(fā)現(xiàn)抑制或沉默宿主USP30基因，能夠抑制塞內(nèi)卡谷病毒的復(fù)制，即USP30可作為靶點用于篩選抑制塞內(nèi)卡谷病毒復(fù)制的藥物；(2)本發(fā)明提供了干擾塞內(nèi)卡谷病毒復(fù)制的小干擾RNA，能夠抑制塞內(nèi)卡谷病毒的復(fù)制；(3)本發(fā)明提供了一種特異性靶向USP30基因的sgRNA，結(jié)合CRISPR?Cas9技術(shù)實現(xiàn)了USP30基因的完全敲除，獲得的單克隆細胞系USP30?KOs對SVA具有抗性表型，能夠顯著抑制SVA在細胞內(nèi)的復(fù)制，為進一步研究USP30基因在細胞內(nèi)調(diào)控病原微生物復(fù)制的分子機制提供研究工具和材料。

技術(shù)領(lǐng)域

本發(fā)明屬于生物基因工程技術(shù)領(lǐng)域，具體涉及一種USP30基因作為靶點在抑制塞內(nèi)卡谷病毒復(fù)制中的應(yīng)用。

背景技術(shù)

塞內(nèi)卡谷病毒(Seneca valley virus，SVA)屬于小RNA病毒科塞內(nèi)卡病毒屬，屬于單股正鏈RNA病毒，主要感染豬。SVA感染引發(fā)的水泡病與口蹄疫(FMD)、豬水泡病(SVD)和水泡性口炎(VS)引起的病變極為類似，具體表現(xiàn)為病畜鼻吻部、蹄部冠狀帶出現(xiàn)明顯水泡，同時伴有跛行、厭食、嗜睡和發(fā)燒等癥狀。如何制定有效的診斷和防控策略以及措施來防止該病的不斷流行和擴散是當前亟待解決的問題。但由于SVA感染與致病機制仍不清楚，仍未有商品化的疫苗或藥物問世。因此深入了解宿主蛋白抑制SVA復(fù)制的機制，通過CRISPR-Cas9技術(shù)構(gòu)建抑制SVA病毒復(fù)制的細胞系對于塞內(nèi)卡谷疫苗的生產(chǎn)意義重大。

RNA干擾技術(shù)的出現(xiàn)對選擇毒性提出了可能，為抗病毒研究提供了新思路。RNA干擾是RNA序列特異性轉(zhuǎn)錄后基因沉默現(xiàn)象。與以往抗病毒治療的手段相比，RNA干擾介導(dǎo)的抗病毒效應(yīng)具有高度的特異性，對非同源基因表達幾乎沒有影響，因此可將不良反應(yīng)降到最小；RNA干擾能高效抑制病毒復(fù)制，少量的siRNA就可達到降低病毒表達產(chǎn)物的作用；RNA干擾可以針對病毒基因組保守區(qū)域發(fā)揮作用，從而在一定程度上限制了病毒產(chǎn)生逃避突變株的能力。因此，設(shè)計合成靶向塞內(nèi)卡谷病毒基因組的siRNAs將可能成為抑制塞內(nèi)卡谷病毒感染的有效途徑。

USP30(ubiquitin specific peptidase 30)是位于線粒體外膜上的跨膜去泛素化酶(deubiquiti nating enzymes，DUBs)，可以抑制由泛素連接酶PARK2和蛋白激酶PINK1介導(dǎo)的線粒體自噬，調(diào)節(jié)線粒體的動態(tài)變化。之前的研究表明，USP30主要逆轉(zhuǎn)線粒體上Parkin底物的泛素化。在神經(jīng)元中，過表達USP30大大減弱了由CCCP誘導(dǎo)線粒體去極化而引起的線粒體自噬對線粒體的清除作用；而降低USP30的活性則增強了線粒體的降解。敲低USP30能緩解Parkin病理活性突變所引起的線粒體自噬障礙，以及在Parkin或者PINK1缺陷的果蠅中增強其線粒體的完整性。

本發(fā)明發(fā)現(xiàn)，通過抑制或沉默宿主USP30基因，能夠抑制SVA的復(fù)制，可作為靶點用于制備抑制塞內(nèi)卡谷病毒復(fù)制的藥物。基于此，本發(fā)明以USP30基因為靶點，設(shè)計了小干擾RNA，所述小干擾RNA能夠干擾SVA的復(fù)制，可用于制備抑制SVA復(fù)制的藥物。而且為了進一步研究USP30基因在細胞內(nèi)調(diào)控病原微生物復(fù)制的分子機制，本發(fā)明設(shè)計了一種特異性靶向USP30基因的sgRNA，所述的sgRNA能夠特異性靶向USP30基因，結(jié)合CRISPR-Cas9技術(shù)實現(xiàn)了USP30基因的完全敲除，獲得的單克隆細胞系USP30-KOs對SVA具有抗性表型，能夠顯著抑制SVA在細胞內(nèi)的復(fù)制，為研究USP30基因在細胞內(nèi)調(diào)控病原微生物復(fù)制的分子機制提供了研究工具和材料，也可用于抗SVA的動物育種。

發(fā)明內(nèi)容